[发明专利]一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法

说明书

本发明涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条。包括样品垫、含有探针Probe1‑AuNPs复合物的金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上分别吸附有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’。本发明开发以纳米金核酸探针作为标记物、通过薄膜层析手段检测灿烂弧菌，为灿烂弧菌的病害防控提供简便快捷有效的检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法。

背景技术

灿烂弧菌（Vibrio splendidus）为弧菌科，弧菌属，是海水养殖动物的主要致病菌之一，可感染鱼类、棘皮动物、双壳贝类和甲壳类等宿主，导致水产养殖病害的发生。由其引发的刺参腐皮综合征能导致刺参嘴肿、厌食、体表溃烂、身体萎缩、排脏等病理反应，最终导致刺参死亡，给水产养殖带来巨大的经济损失。尽早检测与诊断该病原菌是有效预防该类疾病发生的有效手段，因此，研究开发快速准确的病原检测技术非常重要。

目前针对灿烂弧菌的检测方法主要有常规微生物检测技术、基于分子生物学的检测方法（PCR法、斑点杂交等）和基于免疫学的检测方法（荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验、胶体金标抗体的免疫层析试纸条等）。但这些方法存在诸多的缺点和不足：传统的病原菌培养及生理生化检测需要经过分离培养、形态观察、生理生化指标鉴定等，耗时耗力，精度和可靠性有限；基于分子生物学技术的检测方法虽然检测快速、灵敏度高，但容易出现假阳性，并且需要专业技术人员和特殊仪器设备，限制了其在水产养殖业的推广应用；基于免疫学的检测方法是较为简便的检测方法，但都离不开单克隆抗体的制备，而单克隆抗体制备工艺复杂、生产周期长，成为此检测手段开发的瓶颈。

发明内容

为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种简便快捷的水产病原菌灿烂弧菌的金标核酸快速检测试纸条。

本发明提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有探针Probe1-AuNPs复合物的金标垫、与所述金标垫紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；

所述硝酸纤维素膜上设有相互分离的一条检测线和一条质控线；所述检测线由探针probe2组成，所述质控线由探针Probe1’组成；

所述的探针Probe1、Probe2为：从灿烂弧菌毒力基因序列中选择特征保守区段，以其5’端和3’端分别设计探针Probe1和Probe2，其中Probe1的5’端有巯基修饰，再根据Probe1设计其互补序列Probe1’，所述的探针Probe1、Probe2和Probe1’的基因组序列为：

Probe1：5’-SHAAAAAAGCGGAGCCGCCTGCCGAGTC-3’；

Probe2：5’-ACCCTCCACTATGTATAGTT-3’；

Probe1'：5’-GACTCGGCAGGCGGCTCCGC-3’。

本发明还提供一种快速检测水产病害金标核酸试纸条的制备方法，步骤包括：

（1）Probe1-AuNPs复合物的制备：将80-120 µL纳米金溶液和20-40 µL 的1-10μmol/L的probe1混匀反应，再加入混合液继续反应，经离心收集纳米金颗粒；用混合液漂洗、重悬后，最终得到Probe1-AuNPs复合物；

所述混合液是NaCl 和PB的混合液，所述NaCl 浓度为0.05 -0.50mol/L，所述PB浓度为8-12mmol /L；