[发明专利]一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法

权利要求书

1.一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L，Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；

所述渗透液的pH值为5.0～6.5。

2.一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾期；

2)将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落；

3)将所述步骤2)得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液；

4)将所述步骤3)得到的培养液与LB液体培养基混合、培养调整至OD₆₀₀值为0.6～1.0，离心收集单克隆菌体；

5)将所述步骤4)得到的单克隆菌体与权利要求1所述的渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液的OD₆₀₀值为0.6～1.2，得到浸花液；

6)将所述步骤1)得到的花蕾浸入步骤5)得到的浸花液中，得到浸花后的草莓植株；

7)将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子；

8)将步骤7)所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果；

9)将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果；

10)将再次确定为阳性结果的植株的根、茎和叶在荧光下均显示绿色荧光，浸花后的草莓植株转化成功；

所述滤纸被浓度为5～10μg/mL的卡那霉素溶液浸透；

所述步骤1)与步骤2)-6)没有时间顺序限制。

3.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤6)中的花蕾浸入浸花液的时间为0.5～5min。

4.根据权利要求2～3任意一项所述的遗传转化方法，其特征在于，所述浸花液的OD₆₀₀值为0.6～1.2。

5.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的转化载体包括pK7WG2D，所述pK7WG2D包含有新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因。

6.根据权利要求2或5所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的转化载体pK7WG2D的质量与农杆菌感受态细胞的体积比为(0.5～1.5)μg:(150～250)μL。

7.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中的复苏培养基以水为溶剂，包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，所述复苏培养基的pH值为6.5～7.5。

8.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)和4)中的LB液体培养基以水为溶剂，独立地包括以下组分：胰蛋白胨5～15g/L，酵母提取物3～8g/L，NaCl 5～15g/L，壮观霉素40～60mg/L；所述LB液体培养基的pH值为6.5～7.5。

9.根据权利要求2所述的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4)中，培养液与LB液体培养基的体积比为(3～8):(450～550)。