[发明专利]一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法

说明书

本发明提供一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，属于植物生物学技术领域，包括Triton X‑100和Silwet L‑77等。将渗透液与单克隆菌体混合调混合液的OD₆₀₀值为0.6～1.2，对草莓未开的花蕾侵染，从开花到T₁代阳性植株，仅6个月，对比例从取叶片到开花结果得T₁代阳性植株至少14个月，本发明缩短8个月。本发明的转化方法中包括浸花后的草莓种子的荧光检测、幼苗抗生素筛选及幼苗荧光检测阳性植株，对T₁代植株催芽，长出胚芽的种子检测荧光初步判断阳性种子，再置于抗生素溶液浸湿的滤纸上生长，具有叶柄的小三叶植株时，再通过叶片颜色判断阳性植株，后通过荧光验证阳性植株。

技术领域

本发明涉及植物生物学技术领域，具体涉及一种渗透液与一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法。

背景技术

与果树植物相比，草莓具有植株矮小、生产周期短、占地面积小、结果量多、结果时间长、遗传转化体系成熟，且与果树尤其是蔷薇科果树亲缘关系近的优点。草莓现已成为果树学科研究功能基因组的模式植物。

目前常用的稳定草莓转基因方法为农杆菌介导叶盘法，根癌农杆菌介导叶盘法是草莓遗传转化的主要方法，该方法是将草莓植株离体叶片等用根癌农杆菌侵染，产生愈伤组织，经多次愈伤筛选培养，生芽、生根、移栽、检测，最后获得转基因T₀代植株，从开始转化到植株移栽，至少需要8个月的时间；待T₀代植株开花结果后才能获得T₀代种子即T₁代植株，经检测为阳性的才是真正转基因T₁代植株，至少需要6个月；采用农杆菌介导叶盘法从开始转化到获得转基因T₁代草莓植株前后至少共需14个月。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种渗透液，能够缩短获得转基因T₁代草莓阳性植株的时间。

本发明提供了一种渗透液，以水为溶剂，包括以下的组分：MS培养基1.5～2.5g/L，蔗糖40～60g/L，Triton X-100 300～500μL/L,Silwet L-77 300～500μL/L，6-苄氨基腺嘌呤15～100μg/L，吲哚丁酸2～10μg/L和乙酰丁香酮200～400mg/L；所述渗透液的pH值为5.0～6.5。

本发明还提供了一种根癌农杆菌介导的草莓快速简易稳定遗传转化方法，包括以下步骤：

1)通过匍匐茎繁殖的草莓子苗种植于营养土中，培养至现蕾；

2)将转化载体与农杆菌感受态细胞混合后依次进行第一冰浴、液氮处理、水浴和第二冰浴，再与复苏培养基混合，混合后进行涂皿培养，得到单克隆菌落；

3)将所述步骤2)得到的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养，得到培养液；

4)将所述步骤3)得到的培养液与LB液体培养基混合、培养调整至OD₆₀₀值为0.8～1.2，离心收集单克隆菌体；

5)将所述步骤4)得到的单克隆菌体与渗透液混合，调节得到的菌体悬浮液的OD₆₀₀值为1.0～1.5，得到浸花液；

6)将所述步骤1)得到的花蕾浸入步骤5)得到的浸花液中，得到浸花后的草莓植株；

7)将浸花后的草莓植株的种子在3～5℃下贮藏2周，得到贮藏种子；将所述贮藏种子进行催芽处理，得到发芽种子；

8)将步骤7)所述发芽种子在荧光下进行观察，将在荧光下发绿色荧光的发芽种子初步确定为阳性结果；

9)将所述初步确定为阳性结果的发芽种子置于滤纸上进行生长，待长出3小叶具有叶柄植株时，植株叶片绿，再次确定为阳性结果；植株叶片黄，为阴性结果；