[发明专利]镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法

权利要求书

1.镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法，其特征在于所述嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11已于2018年09月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2018642；

包括以下步骤：

1）制备嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗血清，具体方法为：

将嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11接种于0.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27 ℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，4500r/min离心5min，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸ cfu/mL备用；选择2只2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上，即使用；

2）纯化嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗体IgG；

所述纯化嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗体IgG采用以下步骤：

10 mL超纯水洗脱蛋白A柱中的保护液，流速控制在1 min/mL，10 mL 的0.02mol/L PBS平衡柱子；将0.5 mL抗血清同0.5 mL PBS混匀后，经0.22 µm膜过滤，将混合液注入蛋白A柱中，4℃孵育2.5 h；10 mL PBS洗脱杂蛋白，收集于50 mL 离心管中；柠檬酸缓冲液洗脱固定在柱中的IgG，用10个2mL离心管收集流出液，每管1mL；将280nm处吸光度值较大的离心管流出液合并，4℃透析24 h脱盐，冷冻干燥得干粉IgG；

3）标记IgG，具体方法如下：

称取1 mg IgG溶于250µL Na₂CO₃-NaHCO₃标记缓冲液中，与0.2mL的Eu³⁺标记试剂混匀，4℃磁力搅拌12 h；将标记好的IgG经由Sephadex G-50柱子纯化以除去多余的Eu³⁺标记试剂以及蛋白聚集物，洗脱液为Tris-HCl缓冲液，收集流出液，每离心管0.5 mL，监测A₂₈₀值，合并收集A₂₈₀较大的离心管流出液，得IgG标记复合物Eu³⁺-IgG，复合物中Eu³⁺和IgG浓度分别为6.2×10^-6mol/L和3.3×10^-6mol/L，标记比约为2；所述Sephadex G-50柱子采用1×20 cm柱子；

4）建立共发光体系，具体方法如下：

在10 mL 离心管中，依次加入1 mL 1.0×10^-10 mol/L Eu³⁺、1 mL 5×10^-4 mol/L TTA、1mL 7.5×10^-5 mol/L Lu³⁺、1 mL 4×10^-3 mol/L phen、1 mL 0.75% Triton X-100、4mL H₂O和1 mL 0.05 mol/L Tris-HCl，pH7.0，震荡摇匀，室温放置10 min；测量时间分辨荧光值；当考察其中一种物质，Eu³⁺除外，浓度对共发光TRF的影响，配制不同浓度系列的该物质，其它物质浓度保持不变，测量不同浓度下的TRF值；

5）检测嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11的镥铕共发光TRFIA，具体方法为：用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B11稀释成不同浓度，加入到96孔微孔板中，每孔100 µL，60℃包被12 h；洗涤缓冲液洗涤3次，每孔加入200 µL 1% BSA封闭液，37℃封闭2 h；洗涤3次，每孔加入稀释后的Eu³⁺-IgG溶液100 µL，37℃震荡孵育1 h；洗涤6次，每孔加入200 µLLu³⁺缓冲增强液，震荡3 min，每孔加入20 µL 碱性缓冲增强液，调整pH值，震荡10 min后，在多标记分析仪上测量TRF值；测量参数设置如下：激发波长340 nm，发射波长615 nm；设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的TRF值与对照孔的TRF值之比大于2时判断为阳性；

所述镥缓冲增强液的组成为：5×10^-4 mol/L 2-噻吩甲酰三氟丙酮TTA 1 mL，7.5×10^-5mol/L Lu³⁺ 1 mL，0.75% Triton X-100 1 mL，H₂O 6 mL，0.05 mol/L pH 3.1 邻苯二甲酸氢钾-HCl 1 mL混匀；

所述碱性缓冲增强液的组成为：H₂O 1.8 mL，0.53 mol/L Tris-base 0.9 mL，4×10^-2mol/L phen 0.3 mL混匀。