[发明专利]镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法

说明书

镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法，涉及共发光时间分辨荧光免疫分析。制备嗜水气单胞菌B11抗血清；纯化B11抗体；建立共发光体系；检测B11的镥铕共发光TRFIA。在过量Lu³⁺下，Eu³⁺‑TTA‑phen‑Triton X‑100体系的荧光强度增强。对共发光体系条件优化，结果表明当Lu³⁺、TTA、phen、Triton X‑100浓度为7.5×10^‑6mol/L、5×10^‑5mol/L、4×10^‑4mol/L和0.075％时，共发光体系荧光强度最大。应用直接共发光TRFIA法检测B11，检测到1×10³cfu/mL的菌，比用直接TRFIA检测结果降低两个数量级。

技术领域

本发明涉及共发光时间分辨荧光免疫分析，尤其是涉及镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法。

背景技术

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)可引发人类败血症、脑膜炎、腹泻等疾病(辛志明，等.嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制.中国兽医科学.2012,42:708-712)。高灵敏检测嗜水气单胞菌，可有效降低病害造成的损失，起到疾病预防和控制的作用。

免疫检测法操作简单、特异性强，常用于病原菌检测，但酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光抗体法灵敏度不高，时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)是用稀土离子螯合物作为标记，具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定的优点，但由于病原菌为颗粒性抗原，会干扰时间分辨荧光的测定，因此TRFIA法检测病原菌报道不多(林鹏,等.产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法,专利号ZL2011103430972,2011)。有研究表明，向Eu³⁺等稀土离子的螯合物体系中加入一定量的其它稀土离子，可以大大增强原体系的荧光强度，这种特殊的荧光增强现象是称之为“共发光效应”(杨景和,等.稀土元素的共发光效应.山东大学学报,自然科学版,1986:133-138)。基于以上理论，我们首先将Eu³⁺螯合物标记到嗜水气单胞菌抗体上，完成免疫反应后，加入共发光Lu³⁺，由于共发光效应，时间分辨荧光大大增强，从而细菌检测的灵敏度得到极大提高。共发光TRFIA法检测病原菌从未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏的镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法。

所述嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11已于2018年09月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：M2018642。

本发明包括以下步骤：

1)制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗血清；

在步骤1)中，所述制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗血清的具体方法可为：

将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心(4500r/min，5min)，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸cfu/mL备用；选择2只健康的2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用。

2)纯化嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗体(IgG)