[发明专利]一种重组人IL-21蛋白及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种重组人IL‑21蛋白及其制备和应用。将人IL‑21碱基序列进行优化，删去非编码序列及编码序列上的分泌肽段，将IL‑21编码序列与真核表达载体连接进行表达。本发明采用人源的HEK293F人胚肾细胞作为宿主细胞进行蛋白表达，并创新性的采用悬浮培养及转染，提高重组蛋白表达效率。表达的重组蛋白折叠及翻译后修饰都与生理蛋白极其相似，最大程度的保持人IL‑21蛋白的空间结构和生理功能。该IL‑21蛋白具有高纯度、高免疫原性，与商品化IL‑21蛋白相比，具有更强的刺激Tfh细胞分化的能力。可用于免疫治疗和诊断，研究免疫细胞等方面。同时本发明创新性的发现细胞因子IL‑21对外泌体的分泌具有重要作用，可作为外泌体及抗肿瘤研究的新方向。

技术领域

本发明属于人IL-21蛋白表达、制备和应用技术领域，具体涉及一种重组人IL-21蛋白及其制备和应用方法。

背景技术

IL-21是一种重要的自身炎症因子，在多种自身免疫性疾病中均有明显增高，其蛋白制品可广泛应用但不局限于IL-21自身抗体检测，抗IL-21抗体的研制，信号通路的研究，在疾病中作用的研究，新型治疗方法的开发等。外源蛋白的表达往往与多种因素相关，包括复制、转录和翻译的效率，蛋白质的折叠等。尤其是蛋白质的折叠及翻译后修饰很大程度上决定了蛋白质的生理功能和免疫原性。目前常用的表达系统有原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统如：大肠杆菌，真核表达系统常用酵母细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞等；哺乳动物细胞常用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，NSO细胞，SP2/0细胞，Cos-7细胞，PER.C6细胞。上述这些细胞系并不是人源细胞，没有人源细胞的特殊辅助因子、分子伴侣和翻译后修饰，可能会使蛋白错误折叠，许多经过真核表达系统获得的蛋白没有生理功能或生理功能远低于天然蛋白。

本发明将人IL-21碱基序列进行优化，设计引物，采用cDNA为模板删去非编码序列及编码序列上的分泌肽段，将IL-21编码序列与真核表达载体进行连接，提高重组人IL-21蛋白的表达及分泌效率。同时，本发明采用人源的HEK293F人胚肾细胞作为宿主细胞进行蛋白表达，并创新性的采用悬浮培养及转染，提高重组蛋白表达效率。本发明表达的重组蛋白折叠及翻译后修饰都与生理蛋白极其相似，最大程度的保持人IL-21蛋白的空间结构和生理功能。

近几年研究热点之一的外泌体是由细胞分泌的微小囊泡(直径30-150nm)，存在于所有体液之中。这些外泌体囊泡包含独特的RNA和蛋白质，并具有许多生物学功能，例如参与细胞间的交流和信号传递，但人们对外泌体的功能和调控途径仍然知之甚少。本发明创新性的发现重组人IL-21蛋白对人外周血单个核细胞释放外泌体具有重要作用，并存在显著的高浓度抑制现象，该发现尚未有相关文献报道。首次提出IL-21对细胞释放外泌体具有显著的调控作用，本发明认为IL-21对外泌体的影响可作为一个新的研究方向。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种与人IL-21细胞因子空间结构接近并且具有IL-21生理功能的重组蛋白及其制备方法。

一种重组人IL-21蛋白的制备方法，提取Tfh细胞的总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人IL-21基因，引入酶切位点；对载体质粒及目的片段双酶切，经连接酶构建重组质粒；构建成功的重组质粒转染入HEK293F细胞，之后大批量悬浮培养HEK293F细胞，收集培养基上清内蛋白进行纯化获得重组人IL-21蛋白。

上述的制备方法中扩增人IL-21基因的引物包括但不限于以下序列所示：

上游引物：5’-CGGATCCCCTGGTCCACAAATCAAGCTCC-3’,

下游引物：5’-CCTCGAGGGGAATCTTCACTTCCGTGTGTTCTA-3’。

上述的制备方法中分别在上游引物引入Bam H I内切酶位点，下游引物引入Xho I内切酶位点。

上述的制备方法中所述的载体质粒包括：pSecTag2。