[发明专利]基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究装置和方法

权利要求书

1.基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究方法，其特征在于，包括以下使用步骤：

S1、从旱地、林地、湿地和人造地表中分别选取7个行为较为密集的采样点，使用已灭菌的PP广口瓶进行采样，采样量为1L，每个采样点采集两个平行样，每个采样点之间间隔2公里，每隔6个月进行一次采样；

S2、从采集样品表层水体中取样15ml，加入3M的醋酸钠1.5ml；再加入无水乙醇33ml后，混匀，在-20℃下离心3000rd，10min后取出，观察沉淀物的产生，用不同的试剂盒分别进行提取DNA样品；

S3、将S2中提取到的DNA样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品DNA的浓度，选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性PCR扩增，扩增产物采用DNA试剂纯化回收，DNA纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的DNA放置于4℃冰箱中进行冷藏保存，构建克隆测序文库，对PCR扩增后的DNA片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与NCBI数据库的基因序列进行比对；

S4、将基因测序比对结果按照检出物种的分类学标准对上述检测结果进行统计，并通过香农-威纳指数建立数学模型，对物种丰富度和均匀性进行综合评估，其表达式为：

上式中，H为Shannon-Wiener指数，S为物种丰度，Pi代表第i种个体占总个体数的比例；

S5、对每次采样时的采样点通过土地利用类型进行分类统计，每次采样时的采样点某种土地总面积S0，S1，...Sn，对土地对采样点的土地利用变化趋势进行计算，其计算公式为：(S_n-S_n-1)/S_n-1*100％＝η

上式中，η为土地利用变化趋势；

S6、先对任意采样点的各土地利用类型与Shannon-Wiener指数之间的相关性进行分析，再对每个采样点的Shannon-Wiener指数和土地利用变化趋势两者之间的趋势进行分析。

2.根据权利要求1所述的基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究方法，其特征在于：所述S3中构建克隆测序文库包括下列步骤：取2uLS3中的纯化PCR产物与载体pMD18-T连接，转化DH5a感受态细胞，并在37℃恒温培养24-32h；克隆结束后，挑取50个单菌落，使用引物F和R进行菌落PCR验证，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，确认为目的条带，进行后续实验；从上述样品中分别挑取30个单菌落过夜扩大培养，采用TSINGKE质粒提取试剂盒抽提质粒，使用ABI 3730XL测序仪对上述样品进行测序检测。

3.根据权利要求1所述的基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究方法，其特征在于：所述土地利用类型分别为：旱地、有林地、灌木林、疏林地、其它林地、高覆盖度草地、低覆盖度草地、水库坑塘、滩地、城镇用地、农村居民点和其它建设用地；将有林地、灌木林、疏林地、其它林地、高覆盖度草地和低覆盖度草地归为林地统一标识；将水库坑塘和滩地归为湿地统一标识；将城镇用地、农村居民点和其它建设用地归一为人造地统一标识；共分为四种土地利用类型：旱地、林地、湿地和人造地表，所述S6中采用SPSS20.0对各土地利用类型与Shannon-Wiener指数之间的进行相关性分析，所述S6各土地利用类型与Shannon-Wiener指数之间的进行相关性分析结果分为0.05水平上显著相关和0.01水平上显著相关。

4.根据权利要求3所述的基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究方法，其特征在于：通过S6中每个采样点的Shannon-Wiener指数和土地利用变化趋势两者之间的趋势，对土地利用类型进行调控。