[发明专利]基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究装置和方法

说明书

本发明公开了基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究装置和方法，属于鱼类多样性研究领域。通过调查土地利用方式的改变，来分析鱼类种群结构的变化，因为土地利用方式的改变会从宏观到微观多方面改变鱼类的种群结构与组成。例如：人造地表会引起地表温度的增加，从而提高水体温度，影响冷水鱼的优势地位；湿地面积减少或者湿地生境破碎化，阻碍鱼类的洄游甚至破坏鱼类的栖息地；土地利用变化还往往伴随着河流宽度、流速等变化，从而改变部分物种的优势或者劣势地位。

技术领域

本发明涉及鱼类多样性研究领域，尤其涉及基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究装置和方法。

背景技术

经历过数百年的陆地生物多样性锐减过程后，水生生物多样性也面临着同样的挑战，由于人类长时间的过度捕捞，多数渔场亟需保护和重建。需要相关机构和人员以详细的鱼类分布情况、种群特征等信息为基础，以不同鱼类的生理特征和生态需求为依据，制定行之有效的鱼类保护方案。但是，由于水生生态系统透光性差、鱼类迁移路线多变等原因，给基础信息的获取造成了很大难度。传统的鱼类调查手段较为单一，不能清楚及时地给出鱼类的生存格局、多样性、种群密度和种群结构等基本生态信息，导致鱼类生态学中大量基础数据的缺失或滞后。尤其是一些稀有鱼类的检出率极低，稀有鱼类对生态系统的影响却往往起着弥足轻重的作用，与其检出率成反比。这些基础数据的滞后和缺失，是目前限制鱼类生态学发展的瓶颈。

随着分子生物学的发展，eDNA提供了一种高效、精确、无损伤的鱼类检测新技术，在鱼类生态学研究中展现了良好的应用前景，为鱼类生态学迎来大数据时代提供可能。近几年来，eDNA在珍惜鱼类保护、入侵物种调查、鱼类多样性分析和鱼群数量预测等方面都取得了一定的进展与突破。eDNA是以宏基因组学和DNA测序技术为基础，同时也就继承了这两种方法的局限和瓶颈。例如：高通量测序过程中，序列拼接与基因预测的准确性和速度之间的矛盾。在序列拼接和基因预测过程中往往需要涉及诸多算法，但是高速的算法往往以牺牲准确度为代价。与此同时，水体eDNA在回答传统生态学面临的问题时，也面临着复杂的环境因素带来的影响。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统鱼类多样性研究时，时效性低，对环境不友好和调查结果不精确，而提出的基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究装置和方法，有效解决传统鱼类多样性研究时，时效性低，对环境不友好和调查结果不精确的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

基于eDNA土地变化对鱼类多样性的研究方法，包括以下使用步骤：

S1、从旱地、林地、湿地和人造地表中分别选取7个行为较为密集的采样点，使用已灭菌的PP广口瓶进行采样，采样量为1L，每个采样点采集两个平行样，每个采样点之间间隔2公里，每隔6个月进行一次采样；

S2、从采集样品表层水体中取样15ml，加入3M的醋酸钠1.5ml；再加入无水乙醇33ml后，混匀，在-20℃下离心3000rd，10min后取出，观察沉淀物的产生，用不同的试剂盒分别进行提取DNA样品；

S3、将S2中提取到的DNA样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品DNA的浓度，选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性PCR扩增，扩增产物采用DNA试剂纯化回收，DNA纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的DNA放置于4℃冰箱中进行冷藏保存，构建克隆测序文库，对PCR扩增后的DNA片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与NCBI数据库的基因序列进行比对；

S4、将基因测序比对结果按照检出物种的分类学标准对上述检测结果进行统计，并通过香农-威纳指数建立数学模型，对物种丰富度和均匀性进行综合评估，其表达式为：

上式中，H为Shannon-Wiener指数，S为物种丰度，Pi代表第i种个体占总个体数的比例；