[发明专利]一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其特征在于，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上。

4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上；所述插入形成如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

(1)在保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC出发菌株基因组敲除ddh基因，置换为如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，获得C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株；

(2)在步骤(1)获得的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株基因组上插入lysC操纵子，获得所述基因工程菌。

6.一种L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：发酵培养权利要求1-4任一项所述的基因工程菌以产生L-异亮氨酸。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为29～33℃；溶解氧为15～30％，所述％为体积百分比；发酵时间为至少55小时；和/或，氨水调节发酵培养基的pH为6.5～7.0。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，发酵培养时流加50～80％葡萄糖溶液，控制发酵培养基残糖量为1.5～2.5％。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％；余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积百分比。

10.一种重组载体，所述重组载体在多克隆位点上整合了lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

11.如权利要求10所述的重组载体，其特征在于，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示。