[发明专利]一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvC。本发明还公开了所述基因工程菌的制备方法和应用。本发明所述基因工程菌L‑异亮氨酸的产量增加了5％，代谢支路的副产物赖氨酸的合成减弱了45.24％，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

L-异亮氨酸(L-isoleucine，ILE)，化学名为“β-甲基-α-氨基戊酸”，分子式：C₆H₁₃NO₂，相对分子质量：131.17，是八种必需的氨基酸之一，同时又与L-缬氨酸和L-亮氨酸统称为“分支链氨基酸”(BCAAs)。L-异亮氨酸是人体激素、蛋白质合成和能量生成的原料，能够促进蛋白质合成并抑制其分解，在磷脂双层膜蛋白的跨膜结构域相互作用中也发挥至关重要的作用。因此，L-异亮氨酸被广泛应用于食品和医药等行业，具有巨大的商业价值。

传统的L-异亮氨酸生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。提取法是水解蛋白质从混合氨基酸中分离纯化L-异亮氨酸，由于原料来源有限、提取过程中产生大量废水，目前工业生产中已不采用提取法生产L-异亮氨酸。化学合成法是利用丙二酸二乙酯、异戊酸等合成异亮氨酸，但此方法得到的是四种旋光异构体，消旋拆分反应过程复杂，导致生产成本昂贵，限制了该方法的工业应用。目前，工业生产异亮氨酸主要是发酵法，利用微生物的代谢作用可生物合成并过量积累L-异亮氨酸，具有原料成本低、易于控制等优点。国际上，日本发酵法生产L-异亮氨酸占有垄断地位，主要厂家有味之素、协和发酵和田边制药等，大罐菌株产酸能力达30～35g/L，糖酸转化率为20-25％，并可达60-70％的提取率，合计年产量400-500吨。国内厂家主要有梅花集团、阜丰集团、无锡晶海氨基酸公司等，产酸水平及产品质量离日本企业还有一定距离。