[发明专利]一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法

权利要求书

1.一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，包括如下的检测步骤，

（1）样品前处理：

步骤1：提取，称取2g鲜蜂王浆样品至50ml离心管中，在离心管中加入5.0ml乙酸锌溶液震荡5min溶解样品，向样品溶液中加入10ml乙酸乙酯，震荡提取10min后，加入1.0g氯化钠和4.0g无水硫酸锌，涡动1min后，震荡5min，8000-10000rpm条件下离心5min；

步骤2：净化，准确移取上清液5.0ml于装有500mg PSA 的15 mL 离心管中，振荡5min，6000rpm 离心5min，取上清液1.0 mL 于2 mL 离心管中30℃下氮气吹干；

步骤3：上清液氮气吹干后，向离心管中加入500μL 碳酸钠溶液涡旋复溶，再加入500μL丹磺酰氯-丙酮溶液立刻涡旋混匀；于60℃加热15min；衍生化结束后，置于4℃冰箱冷藏10min；最后样品溶液过0.2μm 滤膜；

（2）样品检测：利用氟诺喹酮类药物的检测试剂盒检测。

2.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述氟喹诺酮类药物的检测试剂盒的检测方法包括如下步骤，

S1.氟喹诺酮类试剂盒回升至室温；

S2.取出需要数量的微孔板备齐并插入微孔架上，记录样品和标准品对应微孔并按顺序编号，每个样品和标准孔做2孔平行试验；

S3.加标准品/样品，吸取50μL诺氟沙星标准溶液至对应的微孔中，吸取50μL样品溶液于其余微孔中，吸取75μL诺氟沙星单克隆抗体和甲状腺过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体的混合液于每个微孔中轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；

S4.洗板、揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤三次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；

S5.显色：加入底物显色A液50μl/孔，底物显色B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min；

S6.测定，加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

3.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述终止液选择2mol/L的H₂SO₄。

4.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述底物显色液A液为含0.4～0.6mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液，底物显色B液为四甲基联苯胺溶液。

5.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述洗涤工作液包括含0.05%吐温-20的PBS溶液。

6.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述诺氟沙星标准溶液为选用乙酸乙酯作为溶剂配置成100ng/mL的储存液，于-20℃条件下保存。

7.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备：

动物免疫：氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联物免疫8～10周龄Balb/c小鼠；

细胞融合与克隆化：取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

经筛选得到氟喹诺酮类药物的单克隆杂交瘤细胞株;

细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞用冻存液制成1×109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存；

复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

8.根据权利要求1所述的一种鲜蜂王浆中氟喹诺酮类成分的检测方法，其特征在于，所述甲状腺过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体的制备过程包括：将标记酶甲状腺过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体采用戊二醛交联法进行偶联得到甲状腺过氧化物酶标记羊抗鼠抗抗体。