[发明专利]基因重组胶原样肽MJLGG-34及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基因重组胶原样肽MJLGG-34，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的基因重组胶原样肽MJLGG-34的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：编码所述的基因重组胶原样肽MJLGG-34的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种基因重组胶原样肽MJLGG-34的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)设计并合成MJLGG-34基因：

采用两对互补引物退火合成MJLGG-34基因：

引物T1+：

5'-AATTCGGTGAACCGGGCAACCCAGGTCACAAAGGCCACAAAGGCCAGCCGGGCCAGC-3'；

引物T1-：

5'-CCCGGCTGGCCCGGCTGGCCTTTGTGGCCTTTGTGACCTGGGTTGCCCGGTTCACCG-3'；

引物T2+：

5'-CGGGTCCGCCGGGCGAACGTGGGCCGCCGGGCCCGTGCTGTGGTGGTGGCtaaCTCGAGG-3'；

引物T2-：

5'-GATCCCTCGAGttaGCCACCACCACAGCACGGGCCCGGCGGCCCACGTTCGCCCGGCGGA-3'；

GAATTC为EcoRI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；

将引物T1+和引物T1-进行退火合成反应，同时将引物T2+和引物T2-进行退火合成反应，分别制得片段一和片段二；将片段一和片段二进行退火合成反应，获得MJLGG-34基因；

(2)构建重组载体pET-32a-MJLGG-34：

用EcoRI酶和XhoI酶分别对质粒pET-32a和步骤(1)制得的MJLGG-34基因进行双酶切，再将双酶切后得到的MJLGG-34基因和双酶切后的质粒pET-32a连接，得到重组载体pET-32a-MJLGG-34；

(3)制备表达工程菌pET-32a-MJLGG-34/BL21(DE3)：

用重组载体pET-32a-MJLGG-34转化表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到表达工程菌pET-32a-MJLGG-34/BL21(DE3)；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pET-32a-MJLGG-34/BL21(DE3)表达由目的多肽、His标签蛋白和Trx标签蛋白组成的融合蛋白；

②得到的His标签融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到镍柱，其他的杂蛋白流出；镍柱中的Ni²⁺也能与咪唑结合，用咪唑梯度洗脱，咪唑竞争性结合到镍柱上，释放融合蛋白，然后收集洗脱液；

③目的蛋白的切割和纯化；

④利用高效液相色谱技术纯化目的蛋白，得到基因重组胶原样肽MJLGG-34。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的退火合成反应的条件为：37℃，35min；98℃，3min；95℃，5min。