[发明专利]检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法

说明书

本发明公开了一种检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法，根据PCR扩增时引物和模板精确互补时扩增效率大幅增加的特性，设计3’末端碱基和待测位点野生型碱基互补匹配的引物，同时设计3’末端碱基和待测位点突变型碱基互补的引物，分别进入体系进行扩增，只有特异的引物会特异特定模板，通过高保真DNA聚合酶的扩增，体系中自带的荧光物质与扩增后的产物结合发出荧光，通过Real‑Time PCR仪器直接判断模板是野生型或者突变型。本方法简单高效，无需碱基测序，也不需要进行凝胶电泳，极大提高了准确性，减少了操作步骤，大大节省检验时间。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法。

背景技术

苯丙酮尿症(PKU)是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸(PA)代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。该病症在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，其遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现不均一，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等、脑电图异常。

随着生物工程技术的不断发展，导致苯丙酮尿症的一系列基因突变位点已经被发现。针对该病症目前已经有了一些基因检测方法。如采用DNA测序方法，将突变热点基因的碱基全部测出进行对比分析，从而得到检测结果，但是这种方法耗费时间非常长。

专利CN101899518A公开了一种针对PKU的基因检测方法，在该发明中，通过设计间隔突变位点一段距离的上游引物和下游引物，然后进行PCR扩增，最后进行凝胶电泳，通过操作人员肉眼观察条带来判断。这种方法中其引物设计使得扩增的DNA片段较长，扩增效率不高，并且凝胶电泳操作很繁琐，肉眼观察电泳条带主观性强，对操作人员的能力和经验要求极高，在实际操作中，当有若隐若现的亮点时，极其不好判断，还需要另外单独进行测序进行辅证，而且电泳过程中易受到污染，准确率不是很高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法。

为实现上述目的，所采用的技术方案如下：

检测苯丙酮尿症基因突变位点的方法，先制得检测Y204C、R243Q、Y356X和R413P四个位点的四组引物，

其中，Y204C突变位点的引物碱基序列为：

野生型引物F₁：5’-CCTTGTATAAAACCCATGCTTGCTA-3’；

突变型引物F₂：5’-CCTTGTATAAAACCCATGCTTGCTG-3’；

共同下游引物R：5’-CCATTGACCCTGATGTGGACT-3’；

R243Q突变点位的引物碱基序列为：

野生型引物F₁：5’-ACTGGTTTCCGCCTCCG-3’；

突变型引物F₂：5’-ACTGGTTTCCGCCTCCA-3’；

共同下游引物R：5’-TACTCACGGTTCGGGGGTAT-3’；

Y356X突变点位的引物碱基序列为：

野生型引物F₁：5’-TTTCACTTGGGGCCTACAGTAC-3’；

突变型引物F₂：5’-TTTCACTTGGGGCCTACAGTAA-3’；

共同下游引物R：5’-AGCTAGTGGCTCACCTTTGTC-3’；

R413P突变点位的引物碱基序列为：