[发明专利]一种一步制备酮酸和非天然手性氨基酸的类转氨方法

说明书

本发明公开了一种一步制备酮酸和非天然手性氨基酸的类转氨方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。本发明构建的类转氨反应途径，可以改变反应平衡、直接实现辅酶原位再生、提高转化率等优点，使酮酸的转化率相比于单步氧化脱氨制备酮酸提高了14倍左右，通过控制温度为30℃、pH为9.0、底物浓度为100mmol/L、辅因子浓度为0.01μmol/L，使转化率提高至92％。辅酶总转化数TTN达到5.84×10⁵。为高效生产酮酸和非天然手性氨基酸提供了一条有效途径。

技术领域

本发明涉及一种一步制备酮酸和非天然手性氨基酸的类转氨方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。

背景技术

手性氨基酸广泛应用于制药，食品，化妆品，农业和饲料工业,手性氨基酸的应用令人印象深刻,刺激了大量创新的合成方法。一般来说，这些方法可以分成三种不同的合成路线，包括蛋白质水解提取法生产的氨基酸，化学方法生物催化合成。生物催化合成手性氨基酸有四种策略：(1)酮酸的不对称还原胺化，(2)氨基基团向酮酸的不对称转移，(3)将氨对映选择性添加到α，β-不饱和酸以及(4)氨基醇的缩醛缩合氨基酸转化为醛。

α-酮酸是一类双羰基的化合物，由于反应中心多,比一般化合物更为重要和特殊的化学性质，是有机合成、药物合成及生物合成的重要中间体，在医药、化学合成、化妆品、饲料和食品领域有重要的应用前景。α-酮酸工业生产大多采用双羧基化法、水解法、氧化法和海因法等化学合成法，工艺原料复杂、步骤冗长、环境污染严重，利用环境友好的生物法制备α-酮酸成为发展趋势。相对于转化率低、副产物多、成本高的发酵生产法，生物转化法以其合成步骤简单、副产物少的特点，成为生物绿色合成α-酮酸的首选。具有价格经济性优势的L-亮氨酸是生物转化的理想底物，通过转氨酶(AT，EC2.6.2.X)、氨基酸氧化酶(AAO，EC1.4.3.2和EC1.4.3.3)和氨基酸脱氢酶(AADH，EC 1.4.1.X)等酶都可以实现氨基氧化脱氨作用制备α-酮酸，是最有工业应用价值的制备途径。目前AAO和AT制备法研究较多，但AAO法副产物H₂O₂对细胞或者酶具有明显的毒性和抑制作用，AT法则存在底产物抑制、转化率较低、成本高问题；而氨基酸脱氢酶能够同时可逆催化氨基酸氧化脱氨和酮酸还原胺化反应，但反应选择性取向于还原胺化方向，且需要等当量辅酶参与，途径实现困难大，研究较少。

近年来，人们对氨基酸脱氢酶的催化机制和合成应用研究不断深入，L-氨基酸脱氢酶的合成应用研究主要集中在L-亮氨酸脱氢酶和L-苯丙氨酸脱氢酶，对不同结构的α-酮酸分别具有较高的活性，它们因此被用来合成了一系列的支链和芳香的氨基酸。叔亮氨酸是合成药物的关键中间体，利用L-亮氨酸脱氢酶催化合成叔亮氨酸从1990年代就有报道，目前该生物转化法已经应用于工业化生产，成为利用氨基酸脱氢酶合成非天然氨基酸的典范。亮氨酸脱氢酶LeuDH催化可逆的部分脂肪族氨基酸氧化脱氨和酮酸的不对称还原胺化反应，是氨基酸和酮酸合成的生物途径，但从该酶目前已经报道的酶学性质及应用研究来看，热力学上反应平衡一般倾向于还原方向，是重要的氨基酸和酮酸制备用生物催化剂，而且亮氨酸脱氢酶有广泛的底物谱。亮氨酸脱氢酶催化单步氧化酮酸的方法和酶偶联法都已报道，但是酶偶联法未见报道。L-苯丙氨酸脱氢酶通常倾向于以芳香α-酮酸为底物，应用于合成L-苯丙氨酸及类似的非天然氨基酸。