[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述NK细胞来源于脐血单个核细胞，是脐血中的NK细胞和/或脐血中造血干细胞诱导而来的NK细胞，经过以下方法活化获得：

单个核细胞按细胞密度2×10⁶个/mL接种在含有1～10％脐血自体血浆，200～1500IU/mL的IL-2，10～50ng/mL的IL-15，10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液；

所述CAR的结构包括依次连接的SP、scFv、CD8铰链区、CD28TM+ICD、4-1BB和CD3ζ，CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的CAR-NK细胞，其特征在于，CAR核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，将NK细胞与含有细胞因子的培养基一起培养进行活化，再通过基因修饰使CAR表达于NK细胞中。

4.权利要求3所述CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)脐血单个核细胞分离提取：取脐血，通过密度梯度离心获取单个核细胞；

(2)NK细胞活化：步骤(1)的单个核细胞接种在含有1～10％脐血自体血浆、200～1500IU/mL的IL-2、10～50ng/mL的IL-15、10～30ng/mL的IL-7和50～100ng/mL的IL-21淋巴细胞培养基培养，并在第3d按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液；培养至第5d，收获活化的NK细胞；

(3)用构建有CAR的慢病毒转导活化的NK细胞，培养；获得CAR-NK细胞；

(4)CAR-NK细胞扩增培养：第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液，之后每隔嵌2d按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液，扩增到第15d后，收获细胞。

5.权利要求1或2所述CAR-NK细胞在制备药物中的应用，所述药物治疗的疾病对应于CAR-NK中嵌合抗原的种类。