[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，属于细胞治疗领域、生物制药领域，本发明将脐血作为NK细胞来源，解决了NK细胞系、外周血和自体血来源的CAR‑NK细胞存在一些问题，比如操作复杂，具有成瘤风险，细胞活性不够，细胞数量少，部分异体来源的细胞会引GVHD等问题。

技术领域

本发明属于细胞治疗领域、生物制药领域，具体涉及以脐血作为异体细胞来源的CAR-NK细胞，以及利用人源嵌合抗原受体修饰来进行肿瘤及感染性疾病的治疗。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。

NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。目前已有大量研究针对不同的肿瘤靶点设计出相应的CAR-NK，在实验研究中取得的效果显著，并正在临床研究中验证其可行性。例如专利申请号为CN201810069667的文中阐述了一种靶向CSF1R嵌合抗原受体修饰的NK92MI细胞和T细胞及其制法和应用。申请号CN201810036254文中阐述了一种以CD33为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用。申请号CN201810036245文中阐述了一种以CD19为靶点的特异性抗体、CAR-NK细胞及其制备和应用。

目前相关专利中制作CAR-NK的NK细胞来源主要有3种途径。(1)NK细胞系，包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1和NKL等，其中NK-92在CAR-NK中研究最为广泛，NK-92具有强大的细胞毒性，高表达一系列与细胞溶解相关的分子，例如穿孔素和颗粒酶B。同时缺乏表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptors，KIRs)等表面抑制性受体，抑制性受体信号的缺失使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代NK细胞。但是NK-92也存在着一些明显的缺点，例如致瘤性和潜在的EB病毒易感性等。因此，作为安全考虑，NK-92必须经过辐照后才能够使用。(2)自体外周血来源NK细胞，自体CAR-NK细胞回输，其抑制性受体与自体正常细胞表达的HLA-Ⅰ类分子结合而产生抑制信号，会抑制NK细胞的杀伤效应。虽然肿瘤细胞丢失了经典的HLA-Ⅰ类分子，但是非经典的HLA-Ⅰ类分子HLA-G、HLA-E等的表达，同样能够抑制NK细胞的活化。同时由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。(3)异体外周血来源的NK细胞，异体NK细胞的KIRs由于与患者HLA-Ⅰ类分子并不匹配，因此并不会产生抑制信号引起干扰。但是，异体NK细胞供者血液中存在着以T细胞为主的其他淋巴细胞，这些其他免疫细胞的存在会引起移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。因此在用于治疗之前，必须要清除T细胞，但同时也会损失一些在杀伤过程中起到辅助功能的其他淋巴细胞。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种CAR-NK细胞，该NK细胞来源于脐血单个核细胞。