[发明专利]一种甘蔗白叶病植原体的PCR检测方法

说明书

本发明公开一种甘蔗白叶病植原体的PCR检测方法。根据甘蔗白叶病植原体的SecA基因序列设计特异性引物SecA‑F/SecA‑R,优化反应体系和程序，建立了甘蔗白叶病植原体的PCR检测方法。采用本发明所述特异性引物和方法，只需要进行一次PCR扩增，通过电泳结果是否有特异性条带即可确定检测样品是否被甘蔗白叶病植原体感染，不需要对扩增产物进行测序确定，提高了检测的特异性和准确性，节约了检测时间，降低了检测成本。

技术领域

本发明涉及一种甘蔗白叶病植原体的PCR检测方法，属植物保护技术领域。

背景技术

甘蔗白叶病是由植原体引起的甘蔗毁灭性病害，可造成甘蔗和制糖产业巨大的经济损失。该病于1954年首次在泰国发现，现已广泛发生于印度、巴基斯坦、斯里兰卡、老挝、缅甸、越南、菲律宾和澳大利亚等植蔗国家。在我国，1962年台湾报道了该病的发生，2012年云南省保山蔗区首次检测发现甘蔗白叶病植原体。甘蔗白叶病的主要症状表现为叶片白化、分蘖增多和矮化。病原主要通过带病蔗种进行远距离传播，在田间可通过叶蝉自然传播。目前甘蔗白叶病已在我国云南省的保山、临沧和普洱蔗区发现，且扩展蔓延非常迅速，严重威胁着云南蔗糖产业的健康发展。甘蔗白叶病目前尚无防治方法，唯有通过设立和建设无病区、加强检疫严防病害蔓延和扩散，因此快速准确的鉴定甘蔗白叶病植原体对于病害的防控具有重要意义。

目前，甘蔗白叶病植原体的检测方法为使用依据植原体16S rRNA基因设计的通用引物(P1/P7和R16F2n/R16R2)进行巢式PCR检测，由于此引物为通用引物，因此扩增的特异性不强，产物需要通过测序才能确定是否为甘蔗白叶病植原体，测序费用昂贵，费时费力，且巢式PCR整个实验过程较为繁琐，目前还未出现使用特异性引物检测甘蔗白叶病植原体的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速、灵敏、特异性的甘蔗白叶病植原体检测方法及其特异性引物。

本发明提供的一种检测甘蔗白叶病植原体的特异性引物，由引物SecA-F和引物SecA-R组成，所述引物SecA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物SecA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的一种检测甘蔗白叶病植原体的方法，包括：

(1)反应体系：25μL PCR反应体系：灭菌双蒸水18.8μL，10×PCR缓冲液2.0μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，10mmol/L dNTPs 1.0μL，20μmol/L引物SecA-F 0.5μL，20μmol/L引物SecA-R 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 1.0μL；所述引物SecA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物SecA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)反应程序：94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。

(3)取PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，若扩增出350bp的单一条带，则检测样品感染了甘蔗白叶病植原体，扩增不出此条带则检测样品中不存在甘蔗白叶病植原体。

本发明的优点和有益效果：