[发明专利]一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒。本发明通过以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b‑specific‑Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。相应的，本发明的检测试剂盒，其成分除了商品化的Premix Ex Taq外，主要包括特别设计的牛支原体特异性的引物、探针及配套试剂：M.b‑specific‑Forward，M.b‑specific‑Reverse，M.b‑specific‑Probe，Nuclease‑free water，阳性对照模板。本发明除了用于实验室常规检测牛支原体核酸外，特别适用于无实验室条件下(如基层兽医部门、养殖场等)的现场检测，具有高特异性和灵敏性，是一种快速、准确的牛支原体核酸检测试剂盒，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

牛支原体(mycoplasma bovis，M.bovis)是感染牛的一种重要的致病性病原体，能够引起犊牛肺炎、乳房炎、耳炎、生殖道炎、关节炎、角膜结膜炎、流产与不孕等多种疾病，这些疾病统称为牛支原体相关疾病(MbAD)。近年来，MbAD已经在世界范围内广泛传播，且牛支原体还可以与其他病原造成继发感染或混合感染，给养牛业造成了巨大的经济损失。

目前，对牛支原体的检测方法主要有病原分离培养、血清学检测方法、分子生物学诊断方法。牛支原体的分离培养在试验操作方面要求严格，分离鉴定难度大，分离周期长，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够的可靠依据，影响实验的准确性；血清学检测既费时又费力，而且灵敏度不高；分子生物学方法方便快捷、灵敏度高，主要有常规PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)，这些检测方法虽然避免了上述两类方法的缺陷，但是需要在有精密仪器的实验室中操作，限制了在现场快速检测诊断上的推广应用。iiPCR(恒温隔绝式PCR)方法凭借特异性引物和探针，有效地增加了检测的特异性和敏感性，同时大大提高了检测速度和检测结果的准确率，且该方法实现反应体系的全封闭自动操作，避免了DNA的污染，具有广泛的现场实用性，可确保快速、准确地检测病原体，在病原体的快速定性检测方面具有广阔的应用前景和发展趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体的iiPCR检测方法及检测试剂盒，旨在解决现有技术敏感性不高，检测条件要求过高，准确率低，或反应体系不稳定、不易保藏等问题。

本发明是这样实现的，一种牛支原体的iiPCR检测方法，通过iiPCR法检测牛支原体核酸，该方法以牛支原体的P80基因序列为模板，从P80基因克隆出包含R1序列的M.b序列，以该R1序列为目标设计探针M.b-specific-Probe；其中，所述M.b序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述R1序列为：TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC。

优选地，所述探针M.b-specific-Probe为：5’-F-TGATGCTGCTTCATATGTATTCCC-Q-3’；其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。

优选地，所述M.b序列的克隆引物为：

M.b-specific-Forward：5’-CAAAGATAGTAGAGATAAACCT-3’；

M.b-specific-Reverse：5’-CTGGTTCTTCATATATAACAAC-3’。

优选地，所述iiPCR法包括以下步骤：

(1)以牛支原体的P80基因为模板并设计引物，PCR扩增得到M.b序列产物；

(2)切胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，然后将连接产物导入到DH-5α感受态细胞，筛选出阳性克隆子；