[发明专利]三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法在审
| 申请号： | 201811516522.1 | 申请日： | 2018-12-12 |
| 公开（公告）号： | CN109468401A | 公开（公告）日： | 2019-03-15 |
| 发明（设计）人： | 刘迪秋;李欣;张应鹏;邱炳玲;李珊 | 申请（专利权）人： | 昆明理工大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/04;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/77 |
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| 地址： | 650093 云*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 茄腐镰刀菌 致病菌 三七根腐病 分子检测 检测引物 特异性引物 标准曲线 动态监测 核苷酸序 技术支持 上游引物 数量动态 土壤处理 下游引物 早期诊断 根腐病 种苗 病害 定性 诊断 土壤 种植 | ||
1.一种三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-time PCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：
上游引物Fs-QF:5’CCACGCTTGTGAGCTATGTAGTTC3’；
下游引物Fs-QR:5’CTCTTGAGGTAGACCACAGTAGGC3’。
2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-time PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 提取三七检测样品或土壤的DNA；
(2) 以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃ 2 min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃ 1 min，62℃ 30 s，72℃ 1 min，于72℃时测定荧光值；每个循环结束后自动收集并记录荧光信号；
(3) 实时荧光定量PCR标准曲线的建立
制备浓度在0.0002ng/μL～20 ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T-
(4) 若有荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌茄腐镰刀菌，将上步所得的Ct值带入本发明构建的标准曲线中，计算得到检测样品中茄腐镰刀菌的数量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含2×SYBR Green Mix 10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fs-QF 1μL、下游引物Fs-QR-QR 1μL、DNA模板1μL。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：上游引物Fs-QF和下游引物Fs-QR-QR浓度均为2 μmol/L。
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