[发明专利]玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用

说明书

本发明公开了一种玉米转化事件HiII‑AtAAP1‑1及其特异性鉴定方法与应用。所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼序列，以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼序列。本发明提供的玉米转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米氮素高效利用以及耐除草剂草铵膦的能力。外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；外源基因的表达对受体玉米的生理形态及氮素利用效率均有提高。本发明检测方法可以为利用转化事件进行分子标记检测，提高育种工作效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用。

背景技术

随着畜牧业和玉米深加工业的发展，以及玉米乙醇燃料技术的应用和推广，玉米已成为世界上重要的粮食作物、饲料作物和经济作物，在农业生产和国民经济发展中占有举足轻重的地位。玉米产量的高低、经济效益的好坏直接影响着我国粮食安全以及农业生产的发展。

玉米需肥量大，对氮肥敏感。氮是玉米生长发育必需的营养元素之一，对其生长发育和产量至关重要。在农业生产中，化学氮肥发挥着越来越重要的作用。随着氮肥用量的增加，氮肥利用率普遍降低，损失提高，因而增加了农业生产成本，也直接或间接的产生一系列不良的环境反应。因此，在保证玉米产量的前提下，提高氮肥的利用效率，减少氮肥施用量是当前农业生产亟待解决的问题之一。而通过转基因的方法培育高效吸收氮肥的玉米品种无疑是解决这一问题的有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因玉米的培育方法。

本发明提供的转基因玉米的培育方法包括如下步骤：将目的玉米基因组第10号染色体的第92016364-92016366位之间的碱基替换为外源DNA片段，得到转基因玉米；

所述外源DNA片段含有氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒和耐草铵膦基因bar表达盒；

所述转基因玉米的氮肥利用效率高于所述目的玉米和/或所述转基因玉米的耐草铵膦的能力高于所述目的玉米。

上述方法中，所述氨基酸通透酶基因AtAAP1如SEQ ID NO.3所示，基因全长1458bp，编码SEQ ID NO.8所示的氨基酸通透酶(485个氨基酸组成，蛋白分子量约52kDa)，AtAAP1可促进根系吸收氨基酸并在氨基酸从根到茎的运输过程中起重要作用。该基因在玉米中过量表达，可使玉米在相同氮素水平下株高、叶绿素、植株全氮含量方面有良好表现。

所述耐草铵膦基因bar为来自吸水链霉菌的耐草铵膦基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示，基因全长552bp，编码SEQ ID NO.11所示的草铵膦乙酰转移酶PAT(183个氨基酸组成，蛋白分子量约23kDa)，它可使除草剂草铵膦乙酰化，抑制草铵膦的活性，最终达到耐草铵膦的效果。

进一步的，所述外源DNA片段依次由所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒和所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒组成。

所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒依次由玉米ZmUbi启动子、氨基酸通透酶基因AtAAP1和nos终止子构成。其中玉米ZmUbi启动子大小为1995bp，核苷酸序列为SEQ IDNO.6，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。nos终止子大小为270bp，来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止AtAAP1基因转录，核苷酸序列为SEQ ID NO.7。

所述耐草铵膦基因bar表达盒依次由CaMV35S启动子、耐草铵膦基因bar和CaMVpolyA终止子构成。其中CaMV35S启动子大小为482bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因bar的表达，核苷酸序列为SEQ ID NO.9。CaMV polyA终止子大小为148bp，终止bar基因转录，核苷酸序列为SEQ ID NO.10。