[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法

说明书

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3作为生产菌株，LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为7.75U/g，酶活回收率达到110.85％；LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为9.54U/g，酶活回收率达到101.82％。在相同的转化时间内，以0.5M蔗糖和0.5M葡萄糖为底物连续操作11次，氨基化树脂LX‑1000EA固定化SPase保持39.15％的转化率，94％的残留酶活；氨基化树脂LX‑1000HA固定化SPase保持42.5％的转化率，91％的残留酶活。结果表明，该固定化方法操作简单，固定化酶酶活没有损失，且应用效果很好，具有很高的工业化应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，SPase)具有水解和转苷作用，能以蔗糖为底物，将蔗糖水解为1-磷酸葡萄糖和果糖，且可将葡萄糖基转移至不同受体，是一种很有潜力的糖基化酶。目前广泛应用于曲二糖、熊果苷、L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷、多酚类的糖基化和α-葡萄糖基甘油的制备。

由于游离的蔗糖磷酸化酶存在无法重复利用、使用效率低的缺点，人们尝试通过物理或化学的方法将SPase固定化，使其具备高活力并可以重复利用，从而实现生产的连续化、自动化、可控化；同时，使用固定化的酶还可以使得产品易于分离和精制。2011年，KarelDe Winter等将热处理后的蔗糖磷酸化酶(Spase)加入到四氯化碳中，然后与树脂混合，填充装柱，酶的固定化率达到60％，利用固定化酶水解蔗糖制备α-葡萄糖-1-磷酸，产物α-葡萄糖-1-磷酸的收率为86％。2013年，张奥以戊二醛和三羟甲基为交联剂，实现长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶在壳聚糖微球载体上的固定化。2017年，Juan M.Bolivar等通过将蔗糖磷酸化酶与聚阳离子结合模块Z_basic2融合，实现了非共价固定化蔗糖磷酸化酶，应用该固定化酶制备葡萄糖基甘油产物的产率为85％以上，固定化酶的活力为游离酶的酶活的90％以上，其载体聚阳离子结合模块Z_basic2可再生。但是，由于以上方法存在固定化酶活回收率较低或价格昂贵等问题，因此，获得一种酶活回收率高且应用效果很好的固定化方法以实现工业化生产具有非常重要的意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明目的是提供一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，所述固定化酶的方法步骤如下：

(1)将产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌经发酵培养，离心收集上清，制得蔗糖磷酸化酶粗酶液；

(2)以5～15g氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA为固定化载体，加入35～45mL、0.1M、pH 8的PBS缓冲液，在25～28℃温度下，200rpm震荡15min后在室温静置0.5～1.5h，用滤纸过滤后加入45～55mL的2％戊二醛中，在25～28℃温度下，200rpm震荡4～6h，用蒸馏水洗3次，洗去残留戊二醛，过滤得到处理后的氨基化树脂LX-1000EA和LX-1000HA；

(3)称取1g步骤(2)中处理过的氨基化树脂LX-1000EA或LX-1000HA，加入步骤(1)中得到的蔗糖磷酸化酶，加酶量为4～19U/g，于25～28℃，100rpm震荡固定4～24h，得到LX-1000EA固定化SPase和LX-1000HA固定化SPase。

本发明以产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌为重组菌，重组枯草芽孢杆菌是本研究室前期构建的枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3(吴敬，吴丹，王淼淼，张康：一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，CN107236696A)。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是以枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3为生产菌株，在LB培养基中37℃培养8～10h，然后转接至TB发酵培养基中30℃、200rpm培养48h。