[发明专利]CMPF均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种CMPF均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和标准品溶液，

所述试剂R1由如下组分和含量组成：

磷酸盐缓冲液 50-200mM，

CMPF抗体 5-500mg/L，

NAD辅酶 1-10mM，

G-6-P-Na2 3-20mM，

表面活性剂 0.01-10g/L，

稳定剂 0.1-0.5g/L；

所述试剂R2由如下组分和含量组成：

磷酸盐缓冲液 50-200mM，

G6PDH-CMPF偶联物 5-500U/L，

BSA 0.01-10g/L，

表面活性剂 0.01-10g/L；

所述标准品溶液，其由CMPF与校准品稀释液梯度稀释而成，所述标准品稀释液由如下组分和含量组成：

磷酸盐缓冲液 0.05-0.2M，

BSA 0.01-10g/L，

稳定剂 0.1-0.5g/L；

其中G6PDH-CMPF偶联物的制备，包括如下步骤：

称取100 mgCMPF，用10ml二甲亚枫溶解，10KU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，溶解于200mlpH7.3，100mM的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌15分钟，再加入25 mg水溶性碳二亚胺粉末，室温避光温和搅拌180分钟，装入透析袋，自由通透分子大小<14KD，置4℃透析，每6小时换液1次，连续6-8次；

用超滤膜包对透析液进行浓缩，浓缩体积至30ml，上G200凝胶层析柱3.0×50cm分离产物，收集G6PDH-CMPF峰，共收集80ml，对纯化水透析3次，冷冻干燥，得到4.7KU的G6PDH-CMPF；

其中抗CMPF的特异性鼠源性单克隆IgG型抗体的制备，包括如下步骤：

S1.CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物的制备

将CMPF与载体蛋白质混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF与载体蛋白质进行偶联反应，然后透析得到CMPF-蛋白质偶联物；或者载体蛋白质用多聚赖氨酸代替，得到CMPF-多聚赖氨酸偶联物；

S2.动物免疫

以CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物，以加强免疫1次，3天后细胞融合；

S3.杂交瘤细胞的制备

取步骤S2免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50%PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养；待克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选；

S4.特异性克隆孔筛选

用50 mM的碳酸盐缓冲液稀释CMPF-蛋白质偶联物至100L/孔包被反应微孔4℃过夜或37℃120 min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，用10%小牛血清室温封闭30min，再加入100µl上述步骤S3培养上清液室温反应60min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入四甲基联苯氨底物显色观察；凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性；保留与CMPF-蛋白质偶联物有反应的细胞克隆孔，再采用有限稀释法进行3次克隆筛选，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存，用于制备腹水；

S5.腹水的制备和纯化

将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，以0.5×10⁴-5×10⁵个/只接种到预先用0.5 mL降植烷或液体石蜡致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测定效价；经50%饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存；腹水采用50%饱和硫酸铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50%饱和硫酸铵沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow亲和层析纯化，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90%，获得抗CMPF-蛋白质偶联物特异性单克隆抗体；

其中抗CMPF的兔源性多克隆IgG抗体的制备，包括如下步骤：

S1.CMPF-蛋白质偶联物或CMPF-多聚赖氨酸偶联物的制备

将CMPF与载体蛋白质混合，并加入碳二亚胺，在碳二亚胺作用下，CMPF与载体蛋白质进行偶联反应，然后透析得到CMPF-蛋白质偶联物；或者载体蛋白质用多聚赖氨酸代替，得到CMPF-多聚赖氨酸偶联物；

S2.动物免疫

以10 mg CMPF-蛋白质偶联物/次/只与等量完全福氏佐剂混匀，家兔皮下多点注射免疫，每1-2周1次，连续5次，间隔1周后采用分离颈动脉，收集血液80-120毫升，室温放置2小时，4℃10000 rpm离心30min，分离收集血清；上述血清再用CMPF-蛋白质偶联物，亲和层析柱纯化抗CMPF的特异性IgG型抗体，最后用8% SDS-PAGE检测纯度，需达到90%；获得兔源性多克隆IgG抗体；

上述纯化的兔源性多克隆IgG抗体进一步在pH4.5的50mM醋酸盐缓冲液中用质量比0.1%的胃蛋白酶切除IgG的Fc'端，37℃反应12小时，然后在调或不调pH值的情况下，用饱和硫酸铵和/或SPA和/或CMPF-蛋白质偶联物亲和层析方法纯化F(ab') 2抗体片段；获得特异性的抗CMPF的F(ab')2特异性抗体片段。