[发明专利]利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法

权利要求书

1.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：

一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

2.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

3.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

4.利用基因工程制备农药降解酶方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；

所涉及的引物包括：

一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6；

一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；

(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆，包括如下步骤：

(1)合成大肠杆菌密码子优化后的LcE3的基因片段；

(2)以上述经优化的野生型LcE3的片段为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列为引物，扩增野生型LcE3基因；

SEQ ID NO:3 F-LcE3-NdeI-primer:5’

-tacatATGAACTTCAACGTTTCTCT-3’

SEQ ID NO:4 R-LcE3-XhoI-primer:5’

-tgctcgagGAACAGGTCACGGTGTTTTT-3’；

回收PCR产物，并利用内切酶对回收产物以及所选质粒载体，在上述插入位点进行双酶切；

(3)使用经筛选出的连接酶，将上述PCR产物片段连接到所述的载体中；

(4)摇菌验证目的基因已准确插入载体,且在PCR过程中未引入突变，最终完成野生型LcE3的表达质粒的克隆；

(5)定点突变W251L位点:以步骤(4)获得的野生型LcE3质粒为模板，以SEQ ID NO:5所示的基因序列和SEQ ID NO:6所示的基因序列为引物，进行定点突变，并扩增突变序列；

SEQ ID NO:5 F-LcE3W251L:5’

-TGCCCGctgGCGAACACCCAGTGCCAGCA-3’

SEQ ID NO:6 R-LcE3W251L:5’

-GTTCGCcagCGGGCAGATCGCGTTACCAG-3’

(6)采用制备野生型LcE3质粒类似的步骤，获得LcE3W251L质粒；

(7)在LcE3W251L质粒的基础上，以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，利用所述引物，继续突变F309L位点，最终获得菊酯类农药降解酶LcE3W251L/F309L突变质粒；

SEQ ID NO:7 F-LcE3F309L:5’

-GTTATGctgCCGTTCGGTCCGACCGTTGA-3’

SEQ ID NO:8 R-LcE3F309L:5’

-GAACGGcagCATAACTTTGTTGGTACGTT-3’。