[发明专利]利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法

说明书

本发明公开了一种利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法，所述方法，包括如下步骤：(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；所涉及的引物包括：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8；(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。本发明批量生产具有极高生物活性的羧酸脂酶突变体，从而通过该生物活性物质，有效水解土壤和水质中的菊酯类农药成分，净化生态环境，维护动植物和谐共处的稳态。

技术领域

本发明涉及一种农药降解酶的制备方法，具体涉及菊酯类农药降解酶(LcE3W251L/F309L)的方法。

背景技术

有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树、蔬菜上，是有机氯农药的取代物，其药效高，品种多，防治范围广，成本低，为增加生产、防治传播疾病做出了巨大贡献。但有机磷农药是一种神经毒物，对生物体内的胆碱酯酶有抑制作用，抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱堆积，引起神经功能紊乱，从而导致肌体的损害。在人们生活质量不断提高的同时，有机磷农药在果蔬上残留对人体健康的影响和引起的相关安全隐患问题逐渐引起人们的关注。

目前，有机磷农药污染降解方法主要有超声波、吸附、洗涤和电离辐射等物理方法；水解、氧化分解和光化学降解等化学方法；微生物、降解酶和工程菌等生物方法。其中生物降解方法是利用生物作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，最终降解为水。与物理和化学降解技术相比，具有更加高效、彻底、无二次污染等优势。

有研究报道，双翅目昆虫铜绿蝇(Luciliacuprina,Lc)是一类抗有机磷酸脂类农药的昆虫。此类昆虫中编码羧酸脂酶LcE3的基因因为天然携带了两种不同的突变，导致了他们对有机磷农药的抗性。其中一种突变为羧酸脂酶LcE3第137位氨基酸甘氨酸突变为天冬氨酸，标记为LcE3G137D，另一种突变为LcE3第251位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸，标记为LcE3W251L。其中，LcE3G137D突变体能够对二嗪农杀虫剂产生抗性，其突变发生在LcE3酶活性位点的氧离子洞结构中，虽然阻断了羧酸脂酶的活性，但能够获得有机磷水解酶活性，提高脱磷酸化的速率。另一个LcE3W251L突变体能够对马拉松杀虫剂产生抗性，其突变发生在LcE3催化结构附近的酰基口袋结构中，能够在增强马拉硫磷羧酸脂酶的活性的同时，获得有机磷水解酶活性。同时，从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster,Dm)中分离出来的羧酸脂酶DmEST23是LcE3的直系同源类似物，其相应位点的突变体亦能起到水解有机磷农药的功能。

于是，从昆虫自身携带的抵抗有机磷农药的天然突变体出发，研究者开发出了一系列人工诱导的E3和EST23的突变体，从中筛选出一批极有效的有机磷水解酶和拟除虫菊酯水解酶，包括：LcE3W251L，LcE3F309L，LcE3W251L/F309L，DmEST23W251L。其中，LcE3W251L突变体对反式拟除虫菊酯杀虫剂的水解活性比野生型提高了十倍，水解顺式拟除虫菊酯杀虫剂的活性提高了130倍以上。而LcE3F309L突变体比LcE3W251L突变体具有更强的水解反式拟除虫菊酯杀虫剂的活性。LcE3W251L/F309L同时携带了两个突变，能够极高效地水解绝大部分的顺式异构的杀虫剂。

但是，以上述昆虫为来源，提取相应的水解酶存在诸多问题，极大的限制了其产业化发展和应用。首先，上述果蝇及其突变体培育周期长，培育成本高，想要实现大规模的产业化生产，投入成本高昂；其次，上述突变体产生水解酶的相应基因在多代培育后易突变，使得水解酶活性大大降低，进一步增加了量产难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明首先涉及一组野生型LcE3的基因序列SEQ ID NO:1，和经大肠杆菌密码子优化的LcE3的基因序列SEQ ID NO:2；