[发明专利]一种EBV病毒树鼩动物模型的建立方法

权利要求书

1.一种EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于，经过动物选择、病毒液制备、接种、观察树鼩状态、接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs、qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数、RT-PCR检测PBMCs中EBV相关基因的表达、病理检测而建立的。

2.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的动物选择，选取成年、1-1.5年健康树鼩13只，雌雄不限，体重为120-160g。

3.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的病毒液制备，由B95-8培养裂解产生。

4.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的接种，13只树鼩分为实验组n＝10及对照组n＝3，以Ts1-13表示，实验组经鼻腔滴鼻接种500μlEBV病毒液，为3.9×10⁸拷贝；对照组通过相同的方式接种500μl含10％FBS及1％双抗的RPMI1640培养基。

5.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的观察树鼩状态，接种后密切观察树鼩的状态，当其生命状态差时，及时处死以收集重要器官组织并分析出现状态差的原因，所述生命状态差为表现为不好动，常蜷缩在笼子一角、进食少或不进食及排便不正常等。

6.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs；

A)定期抽血以“0，1，2…”周的方式记录接种前、后抽血时间，接种前抽血1次，接种后定期通过股动脉/股静脉抽血至含EDTA·2Na的抗凝采血管中，每次抽血尽量动作轻柔，保护动物；

B)PBMCs的分离将1ml步骤A)抽取的抗凝血，小心的平铺到3mlPBMCs分离液液面上方，室温400g，离心20min后离心管由上至下分为4层，第二层白膜层即为单个核细胞层，收集细胞层至离心管中并加入PBS或细胞洗涤液充分混匀，室温250g，离心10min，反复重悬洗涤共3次后收集细胞，备用；

C)DNA及RNA的提取将步骤B)获取的细胞悬液分成2份，分别用来提取DNA及RNA；

a)DNA提取加1mlPBS重悬细胞，1000rpm离心7min，弃上清；加入20μl蛋白酶吹打混匀；加入200μl Buffer AL，轻轻震荡15sec，56℃，水浴10min；轻微离心后加入200μl无水乙醇，微量振荡器振荡15sec；将混合液移入吸附柱中，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μl AW1，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μl AW2，室温下14000rpm离心3min；将吸附柱置于另一新的收集管中，室温下14000rpm离心1min；将吸附柱置于一新的1.5ml的EP管中，加入50μl Buffer AE，室温放置2min，室温下8000rpm离心1min；测DNA浓度和纯度，样本置于-20℃保存；

b)RNA提取将细胞悬液于室温1000rpm离心7min，弃上清，加入1ml裂解液RZ，轻轻混匀；放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min后4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，把最上层水相转移到新的EP管中；加入约250μl无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4℃，12000rpm离心30sec；向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec并重复1次，弃废液；将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min以去除残余液体；将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加30μlRNase-Free dd H₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；测RNA浓度和纯度，置于-80℃保存。