[发明专利]一种基于高内涵技术在异形红细胞检测中的应用方法

权利要求书

1.一种基于高内涵技术在异形红细胞检测中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，全血标本处理

具体实验步骤如下

①首先取EDTA-K2抗凝全血450～550μL于1ml的EP管中，然后进行500g离心4～6min去除血浆，得到浓缩红细胞悬液；

②然后加入700～900μL的0.9％氯化钠溶液至浓缩红细胞悬液中，轻轻颠倒混匀后，然后进行500g离心3～5min，静置后除去上清液，重复该步骤两次，得到洗涤后浓缩红细胞；

③取4～6μL洗涤后浓缩红细胞至装有1mL 0.9％氯化钠溶液的EP管中，轻轻颠倒混匀后，得到红细胞悬液A；

④取9～11μL红细胞悬液A至装有1mL 0.9％氯化钠溶液的EP管中，轻轻颠倒混匀后，得到红细胞悬液B；

⑤取80～120μL红细胞悬液B沿孔壁匀速注入高内涵专用的96孔板中，400g离心19～21min；

步骤二，使用高内涵分析系统对处理好的全血标本进行拍照

所编写的高内涵对红细胞拍照程序为：

①Experiment实验名称为高内涵依据所设置的拍摄通道及日期自动生成；

②Plate Type板类型为高内涵专用96PerkinElmer CellCarrier 96孔板；

③Objective物镜为40×long WD；

④Excitation：50％，Transmission：50％，Max Duration＜1min，Temperature：Off，CO₂：Off；

⑤Channel Selection通道包括Bright field(BF)及Digital Phase Contrast(DPC)；

⑥Layout Selection选择需要分析的样本孔(well)，在每个样本孔中随机选择至少10个视野(Fields)；

高内涵可设置不同的拍摄通道。BF通道所拍摄红细胞图片与普通光学显微镜类似，分辨率较普通光学显微镜高，用于呈现图片，不用作进一步分析；DPC通道所拍摄图片，红细胞与背景对比度高，用于高内涵系统对图片的识别与分析；

步骤三，使用高内涵分析系统对所拍摄到的红细胞进行识别与分析

所编写的高内涵对红细胞识别与分析程序为：

①红细胞对象识别均基于DPC模式下所拍摄图片；

②参数计算：对识别出的所有对象分别使用STAR方法计算形态学参数，Standard方法计算光密度、SER features方法计算结构参数；

③分选红细胞与非红细胞：BF模式下可见形态与红细胞相近对象，认为该对象为红细胞，命名为“RBC”，BF模式下未见对象，但对应的DPC模式下可见，认为该对象为非红细胞，命名为“Background”；

④分选正常红细胞与异形红细胞：临床上观察异形红细胞通常采用普通光学显微镜直接观察红细胞形态，而采用高内涵BF通道所拍摄图片同样可到达普通光学显微镜成像效果，故将BF通道下所拍摄到的红细胞形态作为正常红细胞及异形红细胞分选依据，正常红细胞群命名为“Normal RBC”，异形红细胞群命名为“Abnormal RBC”。

步骤四，使用高内涵分析系统进行计算

所编写的高内涵对红细胞计算程序为：

①Define Results定义计算公式为“a/(a+b)”，其中，a定义为“The Number ofAbnormal RBC”，b定义为“The Number of Normal RBC”。

②选定所需进行计算的样本孔及视野，点击“Start”进行计算。

2.根据权利要求1所述的高内涵在异形红细胞中的应用方法，其特征在于：所述步骤二中BF通道的拍摄条件为Time：50ms，Height：2.0μm，Excitation：Transmission，Emission：650-760nm，DPC通道的拍摄条件为Upper Plane：1.3μm，Lower Plane：-3.5μm，Filter：1.0，Speckle Scale：10μm。

3.根据权利要求1所述的高内涵在异形红细胞中的应用方法，其特征在于：所述步骤三中STAR方法具体参数为Population：Objects，Region：Cell，Method：STAR，包括Symmetry，threshold Compactness，Axial，Radial，Profile,其中Profile具体参数包括ProfileInner Region：Cell,Profile Width：4px，Sliding Parabola,Texture SER。Standard方法具体参数包括：Mean，Standard Deviation,Coefficient of Variance，其中Coefficientof Variance具体包括Median，Sum，Maximum，Minimum，Quantile Fraction：50％，Contrast。SER features方法具体参数包括：Scale，Normalization by Kernel，其中Normalization by Kernel具体包括：SER Spot，SER Hole，SER Edge，SER Ridge，SERValley，SER Saddle，SER Bright，SER Dark。