[发明专利]比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素A的方法

权利要求书

1.一种比例型核酸适配体荧光探针，其特征在于：该比例型核酸适配体荧光探针由可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体即OTA核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T组成，该探针的检测限为0.38ng/mL，检测线性范围为5 ng/mL-700ng/mL；所述OTA核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，其核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：1所示。

2.根据权利要求1中所述的比例型核酸适配体荧光探针，其特征在于：所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Alexa Fluor 488。

3.一种如权利要求1或2所述的比例型核酸适配体荧光探针的制备方法，其特征在于：该制备方法包含以下步骤：

将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，再置于4℃静止保存，得到比例型核酸适配体荧光探针。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述OTA核酸适配体与硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。

6.权利要求1或2所述的比例型核酸适配体荧光探针或权利要求3或4所述制备方法得到的比例型核酸适配体荧光探针在检测赭曲霉毒素A中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述比例型核酸适配体荧光探针检测赭曲霉毒素A的方法包括以下步骤：

（1）制备比例型核酸适配体荧光探针溶液：

将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT，再置于4℃静止保存；得荧光探针溶液；

（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线

配制不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液，然后将不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液分别与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A的识别过程，使赭曲霉毒素A与核酸适配体发生特异性反应，从而置换出嵌入在适配体其中的硫黄素T，然后分别连续进行两次荧光检测，并根据两次荧光检测信号之比的结果，建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、荧光比例信号为纵坐标的标准曲线；

（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测

将待测样品与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A识别过程，然后分别连续进行两次荧光检测，并根据两次荧光检测信号之比的结果，代入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出待测样品所含赭曲霉毒素A的浓度。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述OTA核酸适配体和硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm。

10.一种检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）制备比例型核酸适配体荧光探针溶液：

将在5’端标记荧光显色基团的OTA核酸适配体、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT，再置于4℃静止保存；得荧光探针溶液；所述OTA核酸适配体和硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60；

（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线

配制不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液，然后将不同浓度赭曲霉毒素A标准品溶液分别与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A的识别过程，使赭曲霉毒素A与核酸适配体发生特异性反应，从而置换出嵌入在适配体其中的硫黄素T，然后分别连续进行两次荧光检测，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485 nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm；并根据两次荧光检测信号之比的结果，建立以赭曲霉毒素A浓度为横坐标、荧光比例信号为纵坐标的标准曲线；

（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测

将待测样品与荧光比例探针溶液混合均匀，于室温静置10 min，进行赭曲霉毒素A识别过程，然后分别连续进行两次荧光检测，连续两次荧光检测的激发波长分别为425 nm和485nm，发射波长分别为460~650 nm和515~650 nm；并根据两次荧光检测信号之比的结果，代入步骤（2）所建立的标准曲线方程，即可计算出实际样品所含赭曲霉毒素A的浓度。