[发明专利]比例型核酸适配体荧光探针及其检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

本发明公开了一种利用带标记的核酸适配体和核酸四链体染料构建的荧光比例探针，所述核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，即OTA核酸适配体，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。本发明所述赭曲霉毒素A检测方法如下：（1）制备OTA核酸适配体‑硫黄素T混合反应溶液，即比例型核酸适配体荧光探针溶液；（2）建立定量检测赭曲霉毒素A的标准曲线；（3）实际样品所含赭曲霉毒素A的检测。使用本发明所述的荧光比例探针进行赭曲霉毒素A检测的方法，可以抵抗其他核酸或杂质的干扰，降低传统方法检测一次荧光信号带来的实验误差，过程可控，操作简单，并且灵敏度高，检测限仅为0.38 ng/mL，同时本方法在均相溶液环境中便可进行荧光检测，不需要洗脱分离，在临场快速检测中具有较大的应用潜力和推广价值。

技术领域

本发明属于赭曲霉毒素A检测领域，涉及一种比例型核酸适配体荧光探针，包括可特异性识别赭曲霉毒素A并带荧光显色基团标记的核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T，并利用该探针快速均相检测赭曲霉毒素A的方法。

背景技术

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是某些曲霉菌属或青霉菌属产生的代谢产物，是一种真菌毒素，在自然界中广泛分布，毒性很强，经常污染谷类、豆制品、咖啡和葡萄酒等农产品或食品。早在1993年，国际癌症研究机构就把赭曲霉毒素A列为人类致癌物。目前赭曲霉毒素A的检测手段主要以色谱法（如高效液相色谱法，薄层色谱法等）和基于抗体作用的酶联免疫吸附法（ELISA）为主，这些方法或需要大型的仪器设备及复杂的前处理过程，或需要较高的成本，并且抗体的制备和保存都比较困难。发展对于食品中真菌毒素的快速、低成本、操作过程简单的临场检测是我国食品安全问题中的热点问题，是目前我国亟需解决的技术领域。

核酸适配体（Aptamer）最早在1990年被提出，近年来逐渐发展成为一种新型的生物传感器，其本质是一段可与靶分子特异性结合的单链DNA或者RNA，与靶标产生类似于抗原-抗体的识别过程。由于核酸适配体具有结构响应性、高稳定性、高特异性、易修饰、低成本等特点，使其逐渐成为抗体的替代品，目前已初步应用于食品危害因子的检测中，但是部分利用核酸适配体检测赭曲霉毒素A的方法较复杂。因此可依赖核酸适配体构建一些快速、操作简单的赭曲霉毒素A检测方法，并且通过比例型探针设计，提高检测方法对环境的干扰能力，进而增加方法的准确性和稳定性，适应于食品领域的临场检测，具有极大的应用价值和发展潜力。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种比例型核酸适配体荧光探针，由可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体和核酸四链体染料硫黄素T组成，并利用该探针检测赭曲霉毒素A的方法。

本发明中的核酸适配体可特异性识别赭曲霉毒素A，其核苷酸序列为序列表中SEQID NO：1所示，简称“OTA核酸适配体”。

进一步的，所述荧光显色基团为FITC、TET、JOE、HEX、Alexa Fluor 488。

进一步的，所述的比例型核酸适配体荧光探针的制备方法包含以下步骤：

将可特异性识别赭曲霉毒素A并在5’端标记荧光显色基团的核酸适配体（即OTA核酸适配体）、核酸四链体染料硫黄素T溶解在结合缓冲溶液中并混合均匀，再置于低温（4℃）静止保存，得到比例型核酸适配体荧光探针。

进一步的，所述核酸适配体与硫黄素T的摩尔浓度比为1:20~60。

进一步的，所述结合缓冲溶液成分为20~40 mM Tris、8~10 mM镁盐离子、50~70 mM钾盐离子和1 mM DTT。

本发明所制得的比例型核酸适配体荧光探针可以应用于赭曲霉毒素A的简便检测。

本发明所述赭曲霉毒素A的简便检测方法，步骤如下：

（1）制备OTA核酸适配体-核酸四链体染料硫黄素T混合反应溶液，即比例型核酸适配体荧光探针溶液：