[发明专利]一种人血液样本的保存及RNA提取方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种人血液样本的保存及RNA提取方法，先采用装有抗凝剂和Trizol试剂的负压采血管采集血液，室温保存，然后进行RNA提取。采血管内的抗凝剂、Trizol试剂和负压的比例为0.8‑1.2mL:5.5‑8.0mL:2.8‑4.0mL，血液离体后立即得到保护，室温下保存30天，提取得到的RNA的RIN值超过8.0，完整性好，同时纯度高；RNA提取方法简单，能够在15分钟内完成，提取率高，减少血液采集量。总之，采用本发明的负压采血管采集、室温保存血液，简化了提取方法，避免冷链运输，降低成本，便于推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人血液样本的保存及RNA提取方法。

背景技术

随着分子生物学的迅速发展，核酸的研究越来越多。而人血是临床上最容易获得的样本之一，被广泛应用于医学研究、尤其是临床诊断中。从血液样本中提取高质量的总RNA，是进行下游的测序、qPCR、芯片检测等技术的基础。但是，提取高质量的总RNA存在技术难点，RNA难以保存是基因表达组研究的一大瓶颈。首先，RNA非常脆弱，极难保存，由于自然界广泛存在的RNA酶，包括组织内及病原体的RNA酶，使得RNA在室温几分钟内就开始降解，30分钟内完全降解成为检测不可用的小片段，限制了RNA的试验研究。其次，目前RNA的采集和运输要求冷链，而且是干冰冷链，极大限制了RNA的使用范围，提高了运输成本；而且大量运输使得空运成为不可能。最后，现有的RNA提取方法存在操作复杂，提取率低，RNA完整性不好的问题；或者提取用试剂盒的价格昂贵，还需对样本进行特定的预处理，难以推广。

中国专利CN108244094A公开了一种血液保存剂及其配套的采血管，尤其公开了血液保存剂的组成为：抗凝剂、防腐剂、细胞膜保护剂和抗氧剂，其中，抗凝剂为乙二胺四乙酸二甲二水化合物、乙二胺四乙酸三钾，防腐剂为尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、苯甲酸、对苯二酚等，细胞膜保护剂为海藻糖、山梨醇、邻苯二甲酸二丁酯和对苯二甲酸二辛酯等，抗氧剂为α-硫辛酸、二氢硫辛酸、维生素A、维生素C、超氧化物歧化酶和邻氮二菲。该专利文件中公开的试剂确实有利于血液保存，能降低细胞破碎、溶血，以及防止核酸降解，但是并没有突出体现该试剂对RNA保存的作用；另外，采用保护液保存试剂后，在后续的提取步骤中，需先将保护液去除，使得提取过程更加复杂。

中国专利CN106434626A公开了一种人全血冻存样本RNA的提取方法，首先对人血进行处理，然后从血液细胞中提取RNA。人血的处理步骤为：用紫帽采血管获取血液样本，离心、得到血浆和全血细胞，分别装入EP管，全血细胞0.1ml加1ml Trizol，振荡、吹吸至匀质，处理完毕，在-80℃保存，或者直接进行提取步骤。RNA提取步骤包括：解冻、孵育、加氯仿、振荡静置，离心、转移上层液，加入异丙醇、振荡静置，离心、RNA于管底，加入乙醇，离心、去除上清，晾干，得到RNA。该法先对血液样本进行处理，加入Trizol试剂保存全血细胞，在后续的RNA提取过程中不用再添加Trizol，简化了Trizol法提取RNA的步骤，但是增加了血液样本处理的复杂性，需要采血的现场有RNAfree操作台，离心机，移液器及专业技术人员等，使得基层医院的使用或单个样本的采集成为不可能。此外，该法提取到的RNA质量不稳定，RIN值仅在7.7以上，而RNA测序要求RIN值至少在8.0；预处理后的血液仍然需要放置在-80℃的条件下保存，操作复杂，需要冷链运输，成本高。

发明内容