[发明专利]一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法

权利要求书

1.一种新的新金色分枝杆菌表达体系，由克隆载体转染宿主构成，其特征在于，克隆载体在启动子3’端接有碱基序列，该克隆载体从6’至4’依次构建克隆载体的克隆位点，包括以下可操作性元件：耶普拉茨286骨架质粒、Exogenous source基因表达盒、Screeningmarkers基因表达盒；所述耶普拉茨286质粒是酵母附加体质粒，SD序列后连接有目的基因，所述Exogenous source基因表达盒自上方至下方依次含有核糖DNA启动子、IRES核酸序列、Exogenous source基因表达框、rDNA终止子；所述Screening markers基因表达盒包括启动子、Screening markers基因、终止子，所述克隆载体插入克隆位点中，依次构成圆环形状的克隆质粒。

2.根据权利要求1所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系，其特征在于，所述Exogenous source基因表达框中Exogenous source基因为胸腺嘧啶基因。

3.根据权利要求1所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系，其特征在于，所述克隆载体具体为环状结构。

4.根据权利要求1所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系，其特征在于，所述目的基因后续至少连接一个MAD。

5.根据权利要求1所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系，其特征在于，所述Screening markers基因为M328抗性基因。

6.根据权利要求1所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)首先对结核新金色分枝杆菌的还原酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以新金色分枝杆菌染色体DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增目的基因,将聚合酶链式反应产物及质粒JDP-23,分别用HindIII和EcoRI双酶切,酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于18℃连接,电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子,并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌的脱氢酶基因进行比对；

(2)通过GFP亮度验证克隆载体的在新金色分枝杆菌中的表达效果；

(3)构建新金色分支杆菌的表达载体；

(4)将Exogenous source基因表达框插入步骤(2)中的表达载体的Exogenous基因内，获得全新的表达载体，将全新的表达载体转化宿主，经过细致筛选进行宿主阳性转化子的验证。

7.根据权利要求6所述的一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中全新表达载体转化宿主的方法包括电转化法和原生质体转化法。