[发明专利]一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法

说明书

本发明涉及新金色分支杆菌技术领域，且公开了一种新的新金色分枝杆菌表达体系，由克隆载体转染宿主构成，克隆载体在启动子3’端接有碱基序列，该克隆载体从6’至4’依次构建克隆载体的克隆位点，包括以下可操作性元件：耶普拉茨286骨架质粒、Exogenous source基因表达盒、Screening markers基因表达盒；耶普拉茨286质粒是酵母附加体质粒，SD序列后连接有目的基因，Exogenous source基因表达盒自上方至下方依次含有核糖DNA启动子、IRES核酸序列、Exogenous source基因表达框、rDNA终止子；Screening markers基因表达盒包括启动子、Screening markers基因、终止子，克隆载体插入克隆位点中。该新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，具备能够在无诱导条件下对新金色分支杆菌进行表达的优点。

技术领域

本发明涉及新金色分支杆菌技术领域，具体为一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法。

背景技术

新金色分枝杆菌，属于放线菌类，革兰氏染色为阳性，形状为球杆状，生长快。

随着基因组学研究的迅速发展，如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种表达体系应运而生，以满足挖掘新基因及其新功能，构建新型工程菌等的迫切需求。酵母表达体系有很多，如酿酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母和产朊假丝酵母等。

目前十分缺少一种表达体系可在无需诱导条件下进行对新金色分支杆菌进行表达。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，具备能够在无诱导条件下对新金色分支杆菌进行表达等优点，解决了目前十分缺少一种表达体系可在无需诱导条件下进行对新金色分支杆菌进行表达的问题。

(二)技术方案

为实现能够在无诱导条件下对新金色分支杆菌进行表达的目的，本发明提供如下技术方案：一种新的新金色分枝杆菌表达体系，由克隆载体转染宿主构成，克隆载体在启动子3’端接有碱基序列，该克隆载体从6’至4’依次构建克隆载体的克隆位点，包括以下可操作性元件：耶普拉茨286骨架质粒、Exogenous source基因表达盒、Screening markers基因表达盒；所述耶普拉茨286质粒是酵母附加体质粒，SD序列后连接有目的基因，所述Exogenous source基因表达盒自上方至下方依次含有核糖DNA启动子、IRES核酸序列、Exogenous source基因表达框、rDNA终止子；所述Screening markers基因表达盒包括启动子、Screening markers基因、终止子，所述克隆载体插入克隆位点中，依次构成圆环形状的克隆质粒。

优选的，所述Exogenous source基因表达框中Exogenous source基因为胸腺嘧啶基因。

优选的，所述克隆载体具体为环状结构。

优选的，所述目的基因后续至少连接一个MAD。

优选的，所述Screening markers基因为M328抗性基因。

一种新的新金色分枝杆菌表达体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)首先对结核新金色分枝杆菌的还原酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以新金色分枝杆菌染色体DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增目的基因,将聚合酶链式反应产物及质粒JDP-23,分别用HindIII和EcoRI双酶切,酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于18℃连接,电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子,并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌的脱氢酶基因进行比对；

(2)通过GFP亮度验证克隆载体的在新金色分枝杆菌中的表达效果；