[发明专利]人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种人皮肤细胞生长因子纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)人皮肤细胞的分离：利用人皮肤原始样本分离获得人的原代皮肤细胞；

2)人皮肤细胞生长因子的制备：将步骤1)中获得的原代皮肤细胞进行培养、传代，收集皮肤细胞的细胞培养液，经过清洗、酶消化、中和、离心后即可获得人皮肤细胞生长因子；

3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备：通过乙醇注入法利用纳米颗粒脂质体直接包埋步骤2)所获得的人皮肤细胞生长因子，获得人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的人皮肤细胞的分离包括如下步骤：

S1：收集人皮肤原始样本并去除皮下脂肪并称重，消毒后将皮肤组织切成糜状；

S2：将步骤S1中糜状皮肤组织转入含有终浓度2.5mg/ml Collagenase和2.5mg/mlDispase混合酶液的离心管中，消化成组织均浆液a；

S3：在步骤S2所获得的组织匀浆液a和0.25％胰酶以体积比为4:1比例混合，继续消化，获得组织匀浆液b；

S4：在步骤S3中获得的组织匀浆液b中加入10mg/ml的DNA酶持续消化，获得组织消化液；

S5：在步骤S4中获得组织消化液和含有10％FBS的DMEM以1:1体积比混合进行中和，将中和后的消化液用细胞过滤器过滤，获得细胞悬液；

S6：将细胞悬液两次离心去上清液所获得的沉淀即为分离得到的成人的原代皮肤细胞。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)人皮肤细胞生长因子的制备包括以下步骤：

SS1：使用步骤1)中获得原代皮肤细胞进行细胞培养，细胞密度达到80％时进行细胞传代培养，获得皮肤细胞培养液；

SS2：收集SS1中获得的皮肤细胞培养液，使用PBS清洗去除残留的培养基，和TrypLEExpress混合进行消化，获得皮肤细胞消化液；

SS3：步骤SS2中获得的皮肤细胞消化液中的细胞全部脱离后以1:1体积比和含有5％FBS的DMEM混合进行中和，获得中和的细胞悬液；

SS4：步骤SS3中获得的中和的细胞悬液离心去上清液获得皮肤细胞；

SS5：步骤SS5中的皮肤细胞使用皮肤细胞生长因子培养基培养，待培养基变黄时换液，回收皮肤细胞因子培养基；

SS6：将SS5回收的皮肤细胞因子培养基离心收集上清液，收集到的上清液过滤除菌，即可获得皮肤细胞生长因子。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备包括以下步骤：

SSS1：称量大豆卵磷脂8-10g，加入50-60ml无水乙醇和40-50ml双蒸水，搅拌后过滤，获得空白脂质体溶液；

SSS2：将80-100ml的人皮肤细胞生长因子溶解于80-100ml双蒸水中，获得人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液；

SSS3：将步骤S2获得的人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液以8-10滴/min的速度缓慢加入到步骤S1获得的空白脂质体溶液中，搅拌获得人皮肤细胞生长因子稀脂质体；

SSS4：将步骤S3制备的人皮肤细胞生长因子稀脂质体注入超滤膜包中，除去游离的人皮肤细胞生长因子、空白脂质体和乙醇，获得人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤SSS4中获得的人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液可直接分装和/或经过冻干工艺制备成固体成品。

6.如权利要求1所述的制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在皮肤创伤愈合中的应用。

7.如权利要求1所述的制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在制备化妆品中的应用。