[发明专利]一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于：引物序列如下：

正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；

反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。

2.一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：包括检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物和PCR反应液，引物序列如下：

正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；

反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′。

3.根据权利要求2所述的检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包括Taq DNA Polymerase、dNTP、EvaGreen染料和缓冲液。

4.根据权利要求2或3所述的检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性质控品和特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物；所述阳性质控品含有Vesivirus 2117病毒的特异性DNA序列，如SEQ ID NO.1所示；所述特异性扩增内参CHO细胞管家基因GAPDH的引物序列如下：

正向引物：5′-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3′；

反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3′。

5.一种检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将标准阳性模板配制成系列浓度的溶液，加入特异性引物，分别进行实时荧光定量PCR反应，建立标准曲线；

2)提取待测样品基因组RNA，逆转录成cDNA，加入特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，将目的片段的Ct值代入标准曲线，得到待测样品中病毒RNA的拷贝数；所述特异性引物为检测Vesivirus 2117病毒的实时荧光定量PCR引物，序列如下：

正向引物：5′-ACGTTGACGATAGGGGGAGA-3′；

反向引物：5′-CTTTGGCAAAGACCCCGTTG-3′；

所述标准阳性模板含目的片段的序列。

6.根据权利要求5所述的检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：步骤1)中实时荧光定量PCR反应的反应体系为：标准阳性模板1μL，25pmol/μL正、反向引物各1μL，10×PCR buffer 5μL，25mmo1/L Mg²⁺4μL，2.5mmo1/L dNTP4.5μL，10×EvaGreen 5μL，Taq DNA Polymerase 2U，加ddH₂O至反应体系总体积为50μL。

7.根据权利要求5所述的检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：步骤1)、步骤2)中实时荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃3min；95℃15s，60℃1min，40个循环；熔解曲线程序为：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃开始收集荧光信号制作熔解曲线。

8.根据权利要求5所述的检测CHO细胞中Vesivirus 2117病毒污染的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：还包括以下步骤：以阳性质控品为模板，加入特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，如果没有特异性扩增，则步骤2)的检测结果无效；所述阳性质控品含有Vesivirus 2117病毒的特异性DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。