[发明专利]Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立方法

权利要求书

1.一种Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：

第一步，质粒的构建，Slc26a4-pX330载体的构建：找到Slc26a4基因的序列，找到第六外显子上的基因序列，找到第236位氨基酸的编码的三个碱基，并依照此位置设计一个靶点；根据靶序列合成寡核苷酸引物；限制性内切酶Bbs I酶切pX330载体，将所得的酶切产物、原质粒和适量的6×DNA loading buffer进行混合均匀，将oligos和经过酶切过后的载体用T4连接酶连接，再将连接产物进行转化，最终确定构建载体成功；

第二步，质粒转染：把含有质粒的培养基加入到已经加入了2μL的Lipofectamine2000的培养基中，混匀，将混合物加入到六孔板的培养基中，摇匀，放入细胞培养箱中培养，完成质粒转染；

第三步，体外合成修复模板：按照靶点附近的序列体外合成修复模板；

第四步， Slc26a4基因敲入小鼠获得：将连好的有效的Slc26a4-pX330质粒和体外合成的修复模板按照一定的比例混合好，共同转入受精卵的细胞核中，并将受精卵移植到假孕雌性小鼠输卵管内等待发育，随后产下F0代幼崽；待小鼠出生后剪下小鼠脚趾，编号序号，从小鼠脚趾中提取小鼠基因组；

第五步，将剪下小鼠的脚趾进行基因组提取后，将含有靶点附近的突变的小鼠进行T/A克隆实验并进行测序，将含有L236P基因突变的雄性小鼠和野生型CBA / CaJ雌性小鼠交配，产下F1代杂合小鼠；

第六步，将F1代杂合小鼠自交产生后代，取出消化好的鼠尾，以消化好的鼠尾基因组为模板，进行PCR，扩增靶点附近的序列；然后对PCR产物进行纯化，将目的片段和T载体进行连接，将连好的载体转化到感受态细胞中，培养箱中过夜培养，再进行测序；

第七步，取出小鼠，进行RNA的提取，然后再取出适量的RNA提取液，去除DNA；将RNA反转录到cDNA中，反转录出cDNA后，以此为PCR模板，在NCBI上设计mRNA水平上的引物，进行PCR；反转录PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，再进行测序；荧光定量PCR，对PCR仪处理的数据结果进行统计学分析成功获得Slc26a4基因L236P突变小鼠模型的建立。