[发明专利]一种分段调控的连续培养菌种的方法

权利要求书

1.一种分段调控的连续培养菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配置发酵培养基并灭菌，发酵培养基至少含有一种碳源、一种氮源、一种磷源、一种镁源、一种钾源、一种钠源；将菌种经过活化、种子培养后加入装有发酵培养基的串联的1#、2#、3#发酵罐中，控制发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，发酵液通气量为1.0-2.0vvm，搅拌转速在300-600rpm之间，进行I阶段发酵；

(2)发酵一定时间，当发酵液中菌体生长达到稳定期后，I阶段结束，开始连续向1#发酵罐中补加新鲜的补料培养基，并连续导出发酵液，进入2#发酵罐，同时导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐；控制各发酵罐补加和导出发酵液的速率，使罐内液体总体积基本不变；

(3)在上述连续向1#发酵罐补加新鲜的补料培养基后的10-30h内作为II阶段发酵，提高1#发酵罐发酵液通气量至2.0-3.0vvm，搅拌转速提高至500-700rpm，补料培养基中碳源浓度提高至发酵培养基的1.2-1.8倍；在随后的20-50h内进行III阶段发酵，发酵液通气量和搅拌转速分别降低为0.5-1.5vvm和300-500rpm，补料培养基中碳源浓度降至发酵培养基的0.4-0.7倍；随后重复上述过程，进行连续发酵；

(4)从1#发酵罐连续导出发酵液进入2#发酵罐后，2#发酵罐进行IV阶段的中段发酵过程，控制2#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，通气量2.0-3.0vvm，搅拌转速在300-600rpm，此过程不补加新鲜培养基；

(5)导出2#发酵罐的发酵液进入3#发酵罐后，3#发酵罐进行V阶段的后段发酵过程，控制3#发酵罐发酵液pH 6-9，优选pH为7-8，温度28-40℃，优选温度为30-35℃，通气量1.0-2.0vvm，搅拌转速在300-600rpm，发酵过程中持续导出发酵液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)的发酵液进入产品暂存罐或直接进入后续的分离工序进行下步操作。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌种为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，发酵产物为鼠李糖脂。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种碳源选自水溶性碳源和/或油溶性碳源，水溶性碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘油中的一种或多种，油溶性碳源包括菜籽油、棕榈油、棉籽油、玉米油、大豆油、椰子油、橄榄油、花生油中的一种或多种；发酵培养基中碳源优选为至少一种水溶性碳源和至少一种油溶性碳源，搭配作为混合碳源使用；碳源总用量在20-150g/L之间，优选40-80g/L；

至少一种氮源选自有机氮源和/或无机氮源，有机氮源包括酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母浸粉中的一种或多种，无机氮源包括硝酸盐、铵盐中的一种或多种；发酵培养基中氮源优选为至少一种有机氮源和至少一种无机氮源，搭配作为混合氮源使用；氮源总用量在2-50g/L之间，优选5-15g/L。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述I阶段发酵时间为10-80h，优选时间为20-50h。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述补加新鲜培养基的速度为0.1-0.5V/day，优选0.2-0.4V/day，其中V为发酵培养基初始体积。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述II阶段补料培养基中碳源浓度提高至发酵培养基的1.2-1.8倍，所述III阶段补料培养基中碳源浓度降至发酵培养基的0.4-0.7倍，其它组成与I阶段发酵培养基相同。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述连续发酵的周期为至少一个月。