[发明专利]一种分段调控的连续培养菌种的方法

说明书

本发明公开了一种分段调控的连续培养菌种的方法。本发明通过向发酵液中连续补加营养物质以维持菌体代谢，同时连续导出发酵液，进入串联发酵罐进一步发酵；为提高菌体代谢速率，在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料组成等参数。本发明减少了菌种培养和设备清洗次数，有利于简化生产工艺并降低发酵成本。此外，通过分段调控连续发酵工艺，本发明提高了鼠李糖脂产量和发酵生产效率，产品批次稳定性得到提高，易应用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种分段调控的连续培养菌种的方法，具体涉及铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的分段调控的连续培养方法，及其在鼠李糖脂发酵生产中的应用。

背景技术

全球范围内表面活性剂用量巨大，被广泛用于石油、环境、农业、日化、食品和医药等多个领域。但市面上的表面活性剂多是以石油基化学品为原料合成的，受限于石油类资源的储量和不可再生特性。因此，近年来生物表面活性剂的开发广受关注。

除优良的表面活性外，生物表面活性剂还具有绿色、环保、可持续等特点，可被应用于石油、环境、农业、日化、食品和医药等众多领域。鼠李糖脂属于一种新型生物表面活性剂，是由微生物代谢产生的一类具有界面活性的糖脂类产物。鼠李糖脂不是单一结构体，而是由多种同族结构组成的混合物，因而具有优异的界面活性，如增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表面张力等。此外，鼠李糖脂还具有无毒、易于生物降解、生物相容性好等特性，因此具备应用于多个领域的潜力。

在石油领域，常规的一次、二次采油一般仅能采收地下原油的30-40％左右，三次采油的应用可以大大提高石油的总采收率。鼠李糖脂与地层中的残油混合后会产生增溶、乳化及互溶效果,进而把残油驱替出来。已有研究表明，使用鼠李糖脂复配其它驱油剂，采收率可提高20％以上，表面活性剂成本也可显著降低。在环境领域，原油泄漏后将在水体表面形成一层油膜，严重威胁海洋或近海地域的生态环境。鼠李糖脂能够减小油膜与水之间的界面张力，使其分散在水中形成乳液。同时，作为鼠李糖脂产生菌，铜绿假单胞菌具有烃类代谢能力，可进一步分解分散在水中的油膜。鼠李糖脂可100％生物降解，不会对环境带来二次污染。此外，鼠李糖脂还被发现具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，可被开发成新型生物医药或生物农药，为生物表面活性剂的应用提供了新的市场和动力。

鼠李糖脂的生产大多是通过微生物发酵实现的，常见的发酵菌株为铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。专利CN1891831的鼠李糖脂发酵产量为23g/L。专利CN101845468以废弃油脂为碳源，鼠李糖脂发酵产量为35-50g/L。专利CN106987545以粗甘油和地沟油为碳源，发酵产量为50g/L。专利CN105420137以棕榈油为碳源进行发酵，鼠李糖脂产量达60g/L以上。上述专利尝试了不同的培养基配方，但发酵产量相对较低。专利CN107735495采用半连续工艺进行发酵，但大比例地加入新鲜培养基会引起发酵液组分的较大波动，进而导致菌体活性发生改变。

综上所述，目前鼠李糖脂的生产一般采用分批发酵方法，生产效率偏低，导致其成本较高，严重限制了其在下游领域的应用。因此，优化发酵工艺以提升鼠李糖脂发酵产量，进而降低生产成本，是推广鼠李糖脂下游应用的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种分段调控的连续培养菌种，尤其是铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的方法，可延迟菌体衰退，将其应用于鼠李糖脂发酵，可显著提高生产效率。

为实现以上发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种分段调控的连续培养菌种，尤其铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的方法，可在发酵开始后连续补加营养物质以维持菌体代谢，同时连续导出发酵液，维持发酵罐内液体总体积基本不变；为提高菌体代谢速率，还需要在不同阶段分别调控溶氧、pH、补料组成等参数；具体包括如下步骤：