[发明专利]一种基于基因枪的海带转基因育种方法

权利要求书

1.一种基于基因枪的海带转基因育种方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)海带受体细胞的制备；

(2)基因枪子弹的制备；

(3)基因枪轰击；

(4)避光恢复培养；

(5)光照培养。

2.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(1)中海带受体细胞的制备方法为：

选取发育良好的种海带，放散游孢子，将玻片用胶纸封闭边缘，留中间1.5cm×1.5cm空白用于附着游孢子，玻片平铺于托盘中过夜附着游孢子，镜检固着孢子数，收取玻片置于染缸中，4℃光照培养至配子体阶段。

3.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中基因枪子弹的制备方法为：外源质粒混合包埋金粉，具体包括以下步骤：

A.乙醇水溶液洗涤金粉；

B.无菌水重复洗涤金粉3次；

C.无菌水重悬金粉；

D.冰上操作：将外源质粒、CaCl₂、亚精胺和步骤(3)得到的金粉悬液混合均匀后，静置；离心，弃上清；依次使用70％的乙醇水溶液和无水乙醇漂洗沉淀；弃去上清，用无水乙醇重悬沉淀，即得基因枪子弹。

4.根据权利要求3所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述的基因枪子弹的制备中金粉和外源质粒的质量比为2-3mg金粉：5μg外源质粒。

5.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基因枪轰击时，金粉用量为400-600μg/枪；外源质粒用量为0.8-1.2μg/枪；轰击次数1-2次；可裂膜规格为1100-1350psi；轰击距离为3-9cm；真空度25-27inch Hg。

6.根据权利要求5所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基因枪轰击时，金粉用量为600μg/枪；外源质粒用量为1.0μg/枪；轰击次数2次；可裂膜规格为1100psi；轰击距离为9cm；真空度26inch Hg。

7.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(4)中，避光恢复培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间24h。

8.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(4)中，避光恢复培养的培养基为灭菌海水。

9.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(5)中，光照培养的培养条件为：培养温度10℃，培养时间2-8d，光照强度30μE m^-2s^-1。

10.根据权利要求1所述的海带转基因育种方法，其特征在于，所述步骤(5)中，光照培养的培养基为灭菌海水。