[发明专利]一种基于基因枪的海带转基因育种方法

说明书

本发明提供了一种基于基因枪的海带转基因育种方法，涉及转基因技术领域，该方法使用由游孢子附着培养而来的海带配子体为受体细胞进行基因枪转化，金粉用量为600μg/枪；外源质粒用量为1.0μg/枪；轰击次数2次；可裂膜规格为1100psi；轰击距离为9cm；真空度26inch Hg。该方法对影响基因枪转化效率的各项参数和细胞培养体系进行了优化，从而获得更适合海带基因枪的转化体系，提高了转化效率。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种基于基因枪的海带转基因育种方法。

背景技术

海带(Laminaria japonica)是一种生长在低温海水中的大型海生褐藻，具有明显的无性繁殖与有性繁殖世代交替现象，即有配子体世代和孢子体世代。藻体孢子囊释放游动孢子，放散的孢子为单细胞，是天然的原生质体，经萌发后形成配子体，配子体的卵囊和精囊结合形成合子，合子进一步萌发产生幼孢子体，经无性繁殖发育为海带。海带是我国一种重要的大型经济海藻，其用途广泛，主要应用于医药、食品、化工等方面。目前，我国海带养殖面积超过24万公顷，养殖产量83万吨，总体养殖产量占全球总量的29.8％，产量、规模处于世界领先地位。

目前，在我国主要经济海藻栽培方面，海带良种覆盖率总体不足30％，良种数量、优良种苗繁育能力严重不足，已成为制约我国海带产业持续、高效和稳定发展的重大瓶颈因素。目前应用的传统育种方法存在着育种周期长、品系纯度低、品系连续退化、成本高、风险大等缺点，随着分子生物学和基因组学等的飞速发展，分子育种应运而生，将现代生物技术手段整合于传统育种方法中，大幅度提高育种效率，缩短育种周期已成为现代育种的主流方向。

转基因技术(gene transfer)也称遗传转化技术(genetic transformation)是指同源或异源的游离DNA分子被感受态细胞摄取，并得以在新背景下(如细胞、组织、整体水平)表达和遗传的过程。根据感受态建立方式的不同，可以将遗传转化技术分为自然遗传转化和人工转化，人工转化包括基因枪法、聚乙二醇法、脂质体介导法、电击法、超声波法、激光法、显微注射法和低能离子束介导法等。由于基因枪法具有无宿主限制，靶受体材料类型广泛，操作简便快速等优点，在海带基因工程中是常用的遗传转化方法。

基因枪法的基本原理是利用高压气体作为驱动力，将吸附或包裹有DNA的金粉微粒高速发射，击中并穿透受体的细胞壁及细胞膜，达到导入外源DNA的目的。经研究结果表明，基因枪法对海带组织切块、雌配子体以及孢子体幼苗均有效，而且粒子轰击对雌配子体孤雌生殖没有抑制作用，采用其雌配子体，转入外源基因后，某些细胞可萌发为幼孢子体并最终发育为孢子体。基因枪轰击的随机性、对受体细胞的损伤、轰击过程中可能造成外源基因的断裂等导致了转化效率不高。

在基因枪操作过程中，可裂膜压力、DNA浓度、基因枪轰击次数、受体的生理因素、阻挡网与受体之间的距离和真空度等都能影响外源基因的转化效率。中国专利公布CN1057566C公开了一种生产转基因海带的方法，将外源基因用基因枪法转入海带雌配子体中，但未公开可裂膜压力、基因枪轰击次数、轰击距离和真空度等。中国专利公布CN107760721A公开了一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其中金粉用量750μg/枪、真空度28inch Hg、质粒用量1.5μg/枪、轰击距离9cm、轰击次数1次，其作用的受体是鹅掌楸的胚性愈伤组织和悬浮细胞系。中国专利公告CN101024844B公开了高羊茅高频基因枪转化方法，其中轰击距离为2.5cm，氦气压力为1100psi，轰击高度6cm，轰击2次，转化率为6％。

目前，对于基于基因枪技术的海带转基因方法有一定的理论研究，然而一方面是在实验室阶段，实际应用的效果未可知；另一方面，其转化率也不能完全满足实际生产需求。因此，需要找到满足实际生产需求且转化率更好的海带基因枪育种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于基因枪的海带转基因育种方法。获得更适合海带基因枪的转化体系，提高转化效率。