[发明专利]一种甘露糖固定化细胞的方法

说明书

一种甘露糖固定化细胞的方法，属于细胞固定领域。该固定方法以大肠杆菌悬浮液为固定对象，选择了不用反应温度、反应时间以及不同pH的缓冲液对大肠杆菌悬浮液的固定效果，最终确定最优条件。本发明使用简单的糖基蛋白识别原理，在固定化细胞过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，且反应过程温和，同时使细胞载量升高，且能够较大程度保持细胞的活性，提高细胞活性回收率。

技术领域

本发明涉及一种固定化细胞的方法，具体涉及一种甘露糖固定化细胞的方法，属于细胞固定领域。

背景技术

全细胞已经广泛应用于各领域的功能检测，例如生物催化(参见：Z.-J.Zhang etal.,2013)、环境检测(H.Ben-Yoav et al.,2009)、药理学(K.S et al.,2008)以及食品工业(K.Gao et al.,2009)等。同时，全细胞作为微型反应器拥有所有必须的辅因子和酶，因此，它们经常用作制备药物中间体，有价值化学品的生物催化剂(K.Ni et al.,2012)。但游离细胞在培养基或者反应溶液中不稳定，不易连续使用，且对反应环境有较高的要求(参见：S.Yu et al.,2016)。通过固定化获得稳定的细胞，则可实现重复使用，且在生物反应器中可获得极高的菌体浓度，降低使用成本，容易回收，操作简便(G.Rehn et al.,2013)。

传统的固定化技术包括物理吸附(P.Kilonzo et al.,2011)、截留(K.Adinarayana et al.,2005)、交联(Y.-W.Zhang et al.,2010)以及共价固定(K.Ni etal.,2012)。其中，由于结合过程温和，采用物理吸附对细胞活性损失较小，但是由于吸附作用力微弱，导致细胞易从固定载体表面脱落(H.Guedri et al.,2008)；交联和共价固定化可以与细胞之间形成牢固的结合力，但是由于使用戊二醛等双功能交联剂对细胞产生毒性，并且提高了细胞的传质阻力，导致细胞活性大大降低，并且由于细胞表面缺少活性基团以及酶导致共价固定化细胞很难实现(C.Chouteau et al.,2005)。因此，寻找一种新型的固定化细胞的方法尤为重要。

发明内容

针对上述的不足，本发明提供一种甘露糖固定化细胞的方法，该方法可有效固定细胞并保证细胞的活性。

本发明解决技术问题采用的技术方案如下：称取甘露糖磁性纳米颗粒，加入大肠杆菌细胞悬浮液，悬浮液浓度为4.5～25.5mg/mL，在反应温度为4～50℃，选择pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液(盐浓度为10～250mM)、pH为9.0的Tris-HCl缓冲液和pH为10.0-11.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，反应0.25～3h后，强磁性分离，测量上清OD₆₀₀，再加入1mL 10mM磷酸缓冲液，强磁性分离，测量上清OD₆₀₀，计算细胞载量。去除上清后，加入0.5mL甘油，0.5mL pH 8.0缓冲液，测量细胞活性，得到活性回收率。

优选的，称取6份甘露糖磁性纳米颗粒，每份30mg，分别加入2mL大肠杆菌细胞悬浮液，悬浮液浓度为13.5mg/mL，在反应温度为4℃，选择pH为8的磷酸盐缓冲液，盐浓度为50mM，反应2h后，强磁性分离，测量上清OD₆₀₀，再加入1mL 10mM磷酸缓冲液，强磁性分离，测量上清OD₆₀₀，计算细胞载量。去除上清后，加入0.5mL甘油，0.5mL pH 8.0缓冲液，测量细胞活性，得到活性回收率。

所述的甘露糖磁性纳米颗粒的制备方法如下：(1)将FeSO₄·4H₂O和FeCl₃·6H₂O按照摩尔比1：3溶于蒸馏水中，然后转移至三颈圆底烧瓶中，在80℃，搅拌和氮气保护条件下，迅速加入40％的NH₄OH调节溶液至碱性，反应5min后，加入油酸，再搅拌反应25min后，获得的黑色沉淀用无水乙醇和超纯水反复清洗至上清液无色透明，强磁铁沉淀分离，于真空烘箱中烘干，得到油酸磁性纳米颗粒；