[发明专利]基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法

权利要求书

1.一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将一束平行照明的激光光束分束为强度相等、偏振方向一致的两束平行光束，汇聚到物镜的入瞳面，再经过该物镜后变成两束平行光，在荧光样品的表面激发出两个相向传播的倏逝波进行干涉，产生精细的倏逝波条纹照明荧光样品；由物镜接收荧光样品发出的荧光信号后，在成像像面用探测器接收该荧光信号，得到一张混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像；

(2)多次改变倏逝波照明条纹的空间位移和方向，再次拍摄受条纹强度调制的荧光信号，得到一系列混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像，作为原始图像；具体步骤如下：

(2.1)每个方向下的照明条纹通过改变其中一光路的光程使条纹每次移动照明条纹周期的三分之一，实现三步移相；

(2.2)依次改变会聚在物镜入瞳处两聚焦光点的位置，从而激发出另一方向相向传播的倏逝波，干涉形成该方向对应的照明条纹，直到在一个π方位角内均匀产生N/3个方向的照明条纹；

(2.3)每次在改变照明条纹的空间位移或方向时，荧光样品被调制后发出混频信号被探测器接收，形成一张低分辨率图；

(3)将原始图像做傅里叶域迭代更新处理，首先提取原始图像中的倏逝波照明条纹，再将照明条纹与荧光样品的初始估计图相乘得到目标图像，用对应该条纹照明拍摄的原始图像的频谱更新目标图像对应的频谱，并对成像系统的光学传递函数OTF进行校正，不断迭代最终重构出一张荧光样品的超分辨图像。

2.根据权利要求1所述的一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤(1)中采用的物镜为数值孔径NA大于1.33的油浸型物镜，两束平行光束汇聚到该物镜的入射光瞳处，两聚焦点所连直线经过入瞳圆心，两聚焦点的距离接近入瞳直径以尽量充分利用物镜数值孔径，经过物镜的两束聚焦光出射后以超过临界角的角度入射到荧光样品，两束光分别在样品表面产生相向传播的倏逝波，倏逝波干涉形成干涉条纹照明样品。

3.根据权利要求1所述的一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤(2)中，N取30，即采用10个方向的照明条纹，最终生成30张原始图像。

4.根据权利要求1所述的一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤(3)中，首先提取原始图像中的倏逝波照明条纹，获得高精度的条纹调制频率和相位，作为后续迭代算法恢复一张高质量的超分辨图的前提，具体包括以下子步骤：

a.建立某个方向照明条纹三步相移照明时的成像模型：

其中，I^j为第j步相移照明时所拍摄的原始图像，j＝1,2,3；P^j是第j步相移时对应的照明条纹，j＝1,2,3，k₀是照明条纹的调制频率，r是空间坐标，是条纹的相位，m为调制深度，O代表荧光样品的物函数，H是探测点扩散函数，*表示卷积；

b.将公式(1)在傅里叶空间下用矩阵形式表达为：

其中，k是傅里叶空间上的坐标，在I和O之上的上标～表示对应的傅里叶变换，表示光学传递函数OTF；

c.对原始图像的傅里叶变换做自相关，求得精确的调制频率k₀和调制相位

其中，代表相关操作，上标*代表一个复变量的复共轭，将在傅里叶域k′＝±k₀处输出峰值，通过获取峰值位置即求得调制频率k₀；

当k′＝k₀时，方程(3)将满足如下表达式：

因此，调制相位通过如下公式求得：

其中，arg(·)表示某个复数变量的幅值；

d.对所有方向条纹照明下所获得的原始图像作步骤a-c操作，从而获得所有照明条纹的调制频率k₀和相位从而提取出所有照明条纹P_n，n＝1,2,3,…,N。

5.根据权利要求4所述的一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤(3)中，提取照明条纹后，进行图像迭代更新，具体包括以下子步骤：

(3.1)将所有原始图像进行叠加作为一张宽场图像，并将其作为荧光样品物函数O的初始估计图；

(3.2)将步骤(3.1)得到的初始估计图依次用所拍得的在不同条纹照明下的低分辨率图进行更新，每一次迭代更新的具体步骤如下：

a.将初始估计图乘以提取出的某个方向的倏逝波照明条纹P_n，获得目标图像I_tn＝O*P_n；

b.用对应该条纹照明拍摄的原始图像I_n的傅里叶变换频谱更新目标图像I_tn对应的频谱，其更新表达式如下：

其中，为更新的目标函数频谱；

c.用更新的目标图像在空域中按如下表达式更新荧光样品物函数：

其中，为更新的物函数；

d.通过更新光学传递函数OTF实现对成像系统的像差校正，从而获得像差校正后的样品恢复图像，更新光学传递函数OTF的公式如下：

其中，是更新的OTF，ε是一个正常数，防止分母为零的情况出现；

e.执行步骤a-d直到完成所有原始图像的迭代更新；

(3.3)重复执行步骤(3.2)，直到所得到的解收敛，此时输出一张重构的样品超分辨图像。