[发明专利]基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法

说明书

本发明公开了一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，将一束平行照明的激光光束分束为强度相等、偏振方向一致的两束平行光束，激发出两个相向传播的倏逝波进行干涉产生精细的倏逝波条纹照明荧光样品；在成像像面用探测器接收荧光信号，得到一张混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像；多次改变倏逝波照明条纹的空间位移和方向，再次拍摄受条纹强度调制的荧光信号，得到一系列混有荧光样品高低频信息的低分辨率图像作为原始图像；最后将原始图像做傅里叶域迭代更新处理，不断迭代最终重构出一张荧光样品的超分辨图像。本发明可达到约100nm的横向分辨率，可减小背景水平，提高对比度，可校正系统未知像差，可实现活体成像。

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微成像领域，具体地说，涉及一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法。

背景技术

荧光显微术由于其具有非侵入的特点在生物研究和临川诊断的应用中具有举足轻重的作用。然而，由于衍射极限的存在，光学显微镜的分辨率通常无法超过200nm。在过去的几十年里，人们发明出许多技术用以突破这一衍射极限，在这些显微术中，结构光照明显微术(SIM)在生物医学成像中是一有力的工具，因为该方法可以提供较高的时间和空间分辨率，可以实现视频率的成像速度。尽管SIM只能实现两倍分辨率的提升，但它所需要的光功率相对于受激发射损耗显微术(STED)来说要小得多，后者为了实现几纳米量级的分辨率往往需要高达吉瓦/平方厘米的光功率。其他的方法比如光活化定位显微术(PALM)和随机光重构显微术(STORM)相比于SIM在视场很大时则要慢得多，它们在重构一张超分辨图像时，需要上千张的原始图像，这使得这种方法很难应用于在活体成像中。由于人们通常需要观察细胞的整个生命活动，SIM由于其快速、低光毒性和光漂白性而成为一种广受欢迎的成像技术。

基于全内反射模式下的SIM，也即TIRF-SIM相比于传统的SIM有更高的分辨率，这是由于所产生的照明条纹在该条件下更加精细。在全内反射(TIR)模式下，从所拍摄的原始图中精确地获取参数，如照明条纹的调制频率和相位，对于分离叠加的信息分量至关重要。到目前为止，研究人员提出了多种算法提高TIRF-SIM从原始数据以优化的条纹相位重构出超分辨图像。

尽管SIM在分辨率和速度方面具有优良的性能，它对于系统像差和信噪比(SNR)很敏感，由于像差或系统误差导致的图像畸变，以及图像在低信噪比时拍摄，将使重构过程产生错误，从而输出劣质的重构结果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，可实现宽场超分辨显微成像。本发明提出在TIR模式下的条纹照明傅里叶域迭代更新技术，可以实现约100nm的横向分辨率，减小背景噪声水平，以及校正系统未知的光学像差。类似于TIRF-SIM，两个相向传播的倏逝波干涉后产生正弦照明条纹，这种由倏逝波干涉产生的非均匀照明可以将物体更高的频谱信息下调制到系统OTF的带宽范围内，从而实现更高的分辨率。同时，由TIR产生的倏逝波提供了极其薄的一个激发层，因此也提高了探测的对比度，减小了背景噪声水平。在图像重构过程中，针对所拍摄的携带着混频分量信息的低分辨率图像采用傅里叶域迭代拼接更新技术重构一张超分辨图像。条纹照明的傅里叶域迭代更新技术是一种在通过在空间域和傅里叶域之间来回切换迭代的方式依次更新图像的方法，它迭代至解收敛为止，这种迭代方法有助于压制噪声，提高对比度和SNR。相对于SIM来讲，条纹照明的傅里叶域迭代更新技术作为一种优化算法不容易受系统误差影响，它能够在预先未知系统像差的情况下重构出一张高质量的超分辨图。

为了实现上述目的，本发明提供的一种基于全内反射的条纹照明傅里叶域迭代更新超分辨显微成像方法，包括以下步骤：