[发明专利]一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；

(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；

(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。

2.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉中的一种或多种的混合。

3.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取方法可采用常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。

4.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取时除提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA以外，还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知非猪肉或肉制品(牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。

5.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中所用的引物和探针如下：

猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQID NO 3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，探针为SEQ ID NO 4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO 7，5′端CY5标记，3′端BHQ1标记；在脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6，探针为SEQ ID NO 4。

6.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中每个样品同时进行2种荧光定量PCR反应体系

第一种为猪源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。

第二种为脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL^-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-COM-CDV(20ng·μL^-1)2.5μL，引物SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6(10μmol·L^-1)各0.5μL，探针SEQ ID NO 7和SEQ ID NO4(10μmol·L^-1)0.5μL，Rox Reference Dye II 0.5μL，Premix Ex Taq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。