[发明专利]一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明提供一种肉与肉制品中猪源性成分实时荧光检测方法。该方法可检测扩增过程中的荧光信号，不需要普通PCR检测方法所用的电泳，节省检测时间，实时观察检测结果。同时在检测过程中加入扩增内标、阳性对照来避免检测结果假阴性，加入阴性对照、空白对照来避免检测结果假阳性，从多个方面来保障检测结果的准确性。该技术对于提高动物源性食品安全监管水平，确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都具有积极作用。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及肉或肉制品中动物源性成分的检测方法，特别是肉 或肉制品中猪源性成分的检测方法。

背景技术

随着我国经济的快速发展，动物源性商品的消费量在不断增加，经常会遇到不法商家为 追逐经济利益在食品加工过程中对动物源性原料以次充好、掺杂使假等欺诈甚至违法行为。 因此，建立一种快速、准确的动物源性成分鉴别的方法对于提高动物源性食品安全监管水平， 确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都 具有积极作用。

在肉制品加工过程中会加入各种原料，采用各种方法加工，在这些过程中会产生很多抑 制PCR反应的物质，从而导致假阴性的产生。另外由于反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故 障，反应体系错误，聚合酶失活等原因也会造成的假阴性结果。本发明在检测体系中加入了 人工构建的扩增内标(internal amplification control，IAC)，IAC是添加到PCR反应体系中和 目标基因非同源的但可以同时扩增的一段人工构建的DNA序列，可以用来指示假阴性现象。 如果反应体系中加入扩增内标，无论在反应体系中有无目标基因出现，扩增内标的信号总会 出现，如果扩增内标无信号说明PCR反应失败，因此加入IAC可以有效的解决假阴性的现象。

在DNA提取的过程中由于操作失误造成的DNA的丢失，也会造成结果的假阴性，为了 解决这一问题，本发明在检测猪源性成分的同时另外增加一对引物，检测提取的DNA是否 丢失，该引物能够扩增所有脊椎动物的DNA样品，只要能提取到DNA，该引物就能扩增出PCR产物，避免了提过过程中DNA的丢失。

另外由于操作的失误可能造成样品之间的污染，DNA、PCR产物气溶胶污染等，这些污 染可能造成检测结果假阳性，因此在本发明在PCR检测的过程中设置了阴性对照，空白对照。 阴性对照扩增模板DNA来源于非猪源性成分的样品，用来提示是否存在样品污染。空白对 照为PCR检测体系中不加模板DNA，用来提示是否存在DNA、PCR产物气溶胶污染。

发明内容

本发明的目的在于针对肉与肉制品中猪源性成分PCR检测假阳性、假阴性结果现象，提 供一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，具体步骤如下：

(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；

(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；

(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。

1.其中肉或肉制品指的是猪肉，牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉中的一种或多种的混合。

2.采用的基因组DNA的提取方法为常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商 品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。

3.提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA的同时还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知 非猪肉或肉制品(牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。

4.实时荧光定量PCR检测方法所用的引物和探针如下：