[发明专利]用于检测碳青霉烯类耐药基因NDM1-24亚型的LAMP引物组合及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了用于检测碳青霉烯类耐药基因NDM1‑24亚型的LAMP引物组合及其应用。本发明经筛选得到灵敏度高、特异性强、重复性好的LAMP引物组合，由外引物‑F3、外引物‑B3、内引物‑FIP、内引物‑BIP、环引物‑LF和环引物‑LB组成，其分别为含有SEQ ID NO.1～6所示序列的核苷酸序列。利用本发明提供的LAMP引物组合检测碳青霉烯类耐药基因NDM，具有准确率高、特异性好、检测时间短、结果可实时观测的特点，从样品处理到报告结果只需1.5h的快速简便且后期可能用于现场实时检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测碳青霉烯类耐药基因NDM1-24亚型的LAMP引物组合及其应用。

背景技术

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物。近年来，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，随着抗生素使用量的加大，细菌耐药的情况也越发严重。抗生素种类繁多，作用机制多样。

碳青霉烯类抗菌药物如亚胺培南、美罗培南等具有抗菌谱广、抗菌作用强、对多种β-内酰胺酶高度稳定的特点，尤其在治疗耐药革兰阴性菌感染中具有极其重要的地位。但近年来铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药率迅速上升。2009年，英国卡迪夫大学TimothyR.Walsh教授研究团队在肺炎克雷伯杆菌中首次发现了一种新型金属β-内酰胺酶，该酶可以水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类药物，介导菌株对碳青霉烯类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素的耐受。由于该菌株分离自曾在印度首都新德里接受治疗的患者，于是研究者将这一新型金属β-内酰胺酶命名为新德里金属β-内酰胺酶(NewDelhimetallo-β-lactamase1)，即NDM-1，同时以blaNDM-1命名编码NDM-1的基因，携带有blaNDM-1基因的菌株被称为“NDM超级耐药菌”。因此，“NDM超级耐药菌”并不是一种细菌，而是指一类细菌。任何一种细菌在获得能表达blaNDM-1基因后，可以使碳氢霉烯类和其他滭内胺抗生素如青霉素失去功效。含有NDM基因的细菌通常会对多种抗菌药物呈抗药性，限制治疗方法，并导致严重的临床感染，难以治理给临床感染治疗带来很大困难。

常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应、PCR-限制性片段长度多态性分析、PCR-单链构象多态性分析、生物芯片技术、自动DNA测序等。传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；SangerDNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。

LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展LAMP试剂盒的应用推广。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

公开号为CN102242210A的中国专利申请公开了环介导等温扩增超级细菌NDM-1基因的引物及检测超级细菌NDM-1基因的试剂盒及检测方法，公开号为CN102242197A的中国专利申请公开了用于检测NDM-1基因的LAMP试剂盒及其专用引物，公开号为CN103614465A的中国专利申请公开了用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。然而，这些方法均为NDM-1的检测。目前，尚未见使用环介导等温核酸扩增技术检测碳青霉烯类耐药基因NDM所有亚型(已知的1-24亚型)的报道，更无合适高效的引物用于该领域的LAMP检测。

发明内容