[发明专利]TEV蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途

说明书

本发明提供了TEV蛋白酶变体、其融合蛋白及制备方法和用途。本发明提供了经筛选得到的具有独特性能的TEV蛋白酶变体以及融合蛋白。采用本发明的TEV蛋白酶变体与多肽融合表达可以用于快速、高效制备多肽，解决目前重组生产多肽工艺中存在的问题。

本申请要求2018年10月10日提交的中国发明专利申请No.201811177281.2的优先权权益。

技术领域

本发明涉及蛋白质领域，具体涉及TEV蛋白酶。

背景技术

TEV蛋白酶(TEV Protease)是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的Nla蛋白酶中27kDa的活性结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)七氨基酸序列，最常用序列的是Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(或ENLYFQG)，其切割位点在谷氨酰胺Gln(P1)和甘氨酸Gly(P1′)之间(即P1和P1’之间)，其序列专一性远比凝血酶、因子Xa、肠激酶等蛋白酶高。

TEV蛋白酶能够耐受范围广泛的pH(pH 4-8.5)和温度(4-34℃)，对一些常见的增加蛋白可溶性或稳定性的添加剂(乙二醇、EGTA、去垢剂以及还原剂)也都有不同程度的耐受。有研究证明，TEV蛋白酶对乙二醇、EGTA和一些除垢剂(Triton X-100、Tween-20和NP-40)不敏感，当1％CHAPS存在时活性降低，在低浓度变性剂(2M尿素,1％SDS)和还原剂(0.7Mβ-巯基乙醇)中依旧可以保持大部分活性(C.Sun et al.,2012)。

野生型TEV酶在表达和溶解性等方面存在一定的缺陷，所以通过基因工程技术改良的突变体有大量报道。例如，天然的TEV蛋白酶会发生自我切割，在表达和纯化过程中，它会不断由于其它TEV蛋白酶的碰撞而发生构象变化，在特定位点发生自我切割，从而使完整的蛋白酶被截短，活性大大降低。Lucast等人找到的S219N突变体，稳定性得到很大的提高，但是可溶性并不高，有大约95％的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中。Kapust等人使用基因工程点突变了天然TEV蛋白酶的基因序列，得到S219V这一稳定性较高并且酶活性也有稍微提高的突变体，其稳定性比S219N要高出约100倍。其次，TEV蛋白酶表达产量不高，溶解度也非常低。大约只有5％的TEV蛋白酶存在于细胞破碎液的上清中，产量为12.5mg/L。Vanden Berg等人通过基因改组(DNA shuffling)、易错PCR(error-prone PCR)发现了一种可以将产量提高到54mg/L的突变体TEVSH，其溶解度比S219N有很大提高，并且酶活性变化不大。Cabrita，L.D.等人使用PoPMuSiC软件设计，对TEV蛋白酶单点突变体进行稳定性分析，筛选出了五个突变体，它们的可溶性和酶活性相对于野生型TEV蛋白酶都得到提升，同时还得到一个双突变体，其可溶性及酶活性相对于单突变体有显著提高。针对TEV蛋白酶本身的缺点，研究者一直在寻找改良的突变体。例如，TEV Ser135Gly突变体比WT更稳定，可以耐受对更高的温度(40℃)；还有一些突变(T17S，N68D，N177V)可以显著提高TEV蛋白酶的溶解性。

TEV蛋白酶作为一种工具酶已在蛋白质研究和生物制药生产中得到了广泛的应用。可根据目的蛋白的性质选择反应条件。通过设计自身带有组氨酸标签的重组TEV蛋白酶，切割后也很容易利用亲和标签将TEV蛋白酶清除。例如，TEV蛋白酶经常被用于高效切割融合蛋白，但是仅限于在二者都可溶状态下切割。目前采用TEV蛋白酶切割融合蛋白以制备蛋白多肽药物的主流方案是：多肽与标签蛋白(如MBP)融合表达，中间用酶切序列连接；纯化融合蛋白；TEV蛋白酶制备；用TEV蛋白酶切割融合蛋白；分离、纯化酶切产物。这种生产方式的缺点是工艺环节过多，效率不高，不利于控制成本。

针对上述重组生产多肽工艺中存在的问题，发明人找到了一种TEV蛋白酶变体，其适合于根据本发明快速和高效制备多肽。

发明内容