[发明专利]一种银耳漆酶的分离提纯方法

权利要求书

1.一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5L的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4L的土豆培养基，按1∶200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/mL，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，根据步骤一，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，根据步骤二，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5mL，置于10000r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，根据步骤三，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的Sephadex G-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，根据步骤四，然后进行层析脱盐，用20mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10mL/min。

步骤六，根据步骤五，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤二银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的时间为1天-7天。

3.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤二将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的温度为20℃-33℃。

4.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤一液态发酵培养液初始pH为2.0-6.0。

5.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤四、步骤五和步骤六，银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时的温度为25℃-65℃。

6.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤四、步骤五和步骤六，银耳漆酶粗酶液进行催化氧化反应时最适PH为2.0-5.5。

7.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤四和步骤五，磷酸-柠檬酸缓冲液的pH为3.0-10.0，浓度为20mmol/L。

8.根据权利要求1所述的一种银耳漆酶的分离提纯方法，其特征在于：所述步骤四，硫酸铵溶液的饱和度为10％-60％。