[发明专利]一种银耳漆酶的分离提纯方法

说明书

本发明公开了一种银耳漆酶的分离提纯方法，包括以下步骤：将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中4天，可以提高漆酶的分泌量，银耳菌渣菌棒经过液态发酵产得的漆酶粗酶液进行分离纯化，分别通过硫酸铵分级沉淀法去除杂蛋白、Sephadex g‑25层析脱盐、Q‑Sepharose Fast Flow离子交换层析后，得到纯的漆酶，测定纯化倍数28.27，回收率达到28％，通过SDS‑PAGE凝胶电泳测得银耳漆酶分子量约为63.4KDa，有效提高了漆酶纯度，而且增加了漆酶的回收率，简单方便，适合广泛推广。

技术领域

本发明涉及银耳漆酶技术领域，特别涉及一种银耳漆酶的分离提纯方法。

背景技术

漆酶是一种来源广泛的多酚氧化酶，漆酶的分子结构中含多个铜原子，催化氧化反应的底物为多种芳香族化合物来，自然界中的多种植物、动物、细菌、真菌都可产漆酶，其中真菌是漆酶产酶的主要来源，并较之其他来源的漆酶，真菌漆酶表现出较高较稳定的氧化能力，漆酶因其可以催化范围丰富的底物而表现出在多领域具有应用潜能，漆酶具有独特的催化特性，作用底物较为广泛，被主要应用于造纸、环境生物修复、生物监测、食品工业等多个领域，并表现出在生物制浆、有毒化合物降解等多个领域的应用潜力，从上世纪中期开始，大量来自植物、细菌和真菌等不同来源的漆酶已经被研究人员进行了分离纯化，但是使用传统的方法进行漆酶分离提纯，所得到的漆酶纯度不高，回收率低，而且漆酶的分泌量低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种银耳漆酶的分离提纯方法，可以有效解决背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种银耳漆酶的分离提纯方法，包括以下步骤：

步骤一，首先配置液态发酵培养液，在容积为5L的玻璃发酵罐中装入100g银耳菌棒，加入容积为4L的土豆培养基，按1∶ 200比例加入氮源和无机盐溶液进行混合，并直接向培养基中加入氨苄青霉素溶液，终浓度达到100mg/mL，在27℃的环境中进行静置培养，以6天为培养周期。

步骤二，根据步骤一，然后配置漆酶粗酶液，将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养，即可得到漆酶粗酶液。

步骤三，根据步骤二，再将得到的漆酶粗酶液进行分离，将在玻璃发酵罐中液态发酵培养的粗酶液取1.5mL，置于10000 r/min下离心10min，取上清液测定其酶活力，然后将培养基放置3min，将培养基从发酵罐中放出通过真空泵真空抽滤，去除菌渣等杂质，然后将滤液用冷冻离心机8000r离心10min，所得上清液即为漆酶粗酶液。

步骤四，根据步骤三，漆酶粗酶液提纯，首先进行硫酸铵沉淀，在4℃条件下，向一定量的漆酶粗酶液中加入硫酸铵溶液以分离主要的漆酶蛋白，除去部分杂质。用磷酸-柠檬酸缓冲液对沉淀下来的目的蛋白进行溶解，用含有0.45μm滤膜的抽滤系统对复溶粗酶进一步去除颗粒杂质，之后将进行过抽滤的粗酶液上样到预平过的Sephadex G-25排阻层析柱进行脱盐处理。

步骤五，根据步骤四，然后进行层析脱盐，用20mmol/L磷酸 -柠檬酸缓冲液进行洗脱，流速控制在10mL/min。

步骤六，根据步骤五，最后进行离子交换层析，将经过脱盐处理的有漆酶活性的部分进行Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析，将不同的蛋白分离，并且通过以流速为10ml/min不断提高盐浓度进行梯度限行洗脱，将漆酶活性部分提取收集，采用透析的方法去除多余氯化钠，即可得到纯化后的漆酶酶液，并把纯化后的漆酶酶液放入4℃冰箱保存备用。

进一步地，所述步骤二银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的时间为1天-7天。

进一步地，所述步骤二将银耳菌棒完全浸没在液态发酵培养液中，静置培养的温度为20℃-33℃。

进一步地，所述步骤一液态发酵培养液初始pH为2.0-6.0。