[发明专利]条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用

权利要求书

1.一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，其特征在于，包括：

分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；

XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；

pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。

2.根据权利要求1所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述pLX-sgRNA-EGFP质粒进行钝化，包括：

步骤201，加入质粒体积的1/10体积的3M醋酸钠，混匀；

步骤202，加入步骤201溶液体积的2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；

步骤203，4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用5-10倍体积预冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm离心10min，吸走上清；

步骤205，真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。

3.根据权利要求2所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：

步骤301，293FT细胞铺板：提前一天在10cm²培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；

步骤302，侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭质粒，各质粒使用量分别为3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL转染试剂，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；

步骤303，用PBS清洗293FT细胞两次并加入5-8mL2-10%293FT细胞培养基，滴加混合液；

步骤304，将上述293FT细胞放置37℃细胞培养箱培养，4-6h后弃去培养液，继续用2-10%293FT细胞培养基培养，37℃、5%CO₂培养箱内培养；

步骤305，经过48h后和经过72h后分别收集病毒液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。