[发明专利]条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用

说明书

本发明具体涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系及其构建方法，包括：分别以pLX‑sgRNA‑EGFP载体为模板，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6‑Aqp11‑sgRNA片段；XhoI和NheI两个酶双酶切pLX‑sgRNA‑EGFP载体和hU6‑Aqp11‑sgRNA片段，得到pLX‑sgRNA‑EGFP载体骨架和hU6‑Aqp11‑sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒；pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11‑sgRNA‑EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-CAS9系统)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，作为第三代基因编辑技术，它能有效的识别特定的DNA序列，并在该特定位点进行切割，导致DNA双链断裂，在缺少特定模板的条件下，基因组修复依靠非同源重组末端连接，结果造成该基因的移码突变，导致基因表达破坏，相应蛋白功能的缺失，引起相应生物学的改变，成为基因功能研究及药物开发和疾病治疗潜在应用技术。

水分占成年哺乳动物体重的65%以上，水分转运在动物新陈代谢和正常生命活动中发挥非常重要作用。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，主要参与转运水和小分子溶质（如甘油、尿素等），同时可能还参与一些气体（CO2、O2、NO和NH3）的转运。目前，在哺乳动物上已发现了13种水通道蛋白亚型（AQP0-AQP12），其中AQP11近年来被证实具有运输水分的功能且效率与AQP1相当。研究发现，Aqp11基因的缺失会提高小鼠发生早期肾脏病变的可能性，而Aqp11基因表达异常则会影响孕妇的羊水量，此外Aqp11在胚胎着床和早期发育过程中其表达量和定位会发生改变，这提示Aqp11基因可能在胚胎发育和疾病中发挥着重要作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。

本发明条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，包括：

分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；

XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；