[发明专利]一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂

权利要求书

1.用于检测马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP引物组，其特征在于：所述引物组由以下引物组成：

上游内引物FIP：CATCGGATACGTCGTCAGACGG-AGGGACGAAACCCCGATAC；

下游内引物BIP：ACTGAGTCGCTGCGATTGGAG-TGGGCCAGTCTGTACCAT；

上游外引物F3：GGAAGGAAAACCGGTTGGAA；

下游外引物B3：GTTCAGGTGGGTGCCTTG；

PLRV-LF：CAGGTTGTCTTTCCTGCGTTT；

PLRV-LB：AGTACCTACGATGCTACAGTCG。

2.一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂，其特征在于：所述试剂包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括如下组分：10×Bstbuffer、浓度为100mmol·L^-1的Mg²⁺、dNTPs、浓度为2U·μL^-1的UNG、浓度为8U·µL^-1的Bst3.0DNA聚合酶、引物混合液、终浓度为2ng·µL^-1的RNA样品、SYBR Green I、 DEPC H₂O。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述dNTPs中dATP、dGTP、dCTP的浓度为10mmol·L^-1，dUTP的浓度为 30 mmol·L^-1。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物混合液中，F3和B3的浓度为2μmol·L^-1，FIP和BIP的浓度为8μmol·L^-1，LF和LB的浓度为6 μmol·L^-1。

6.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括阴性对照和阳性对照。

7.一种马铃薯卷叶病毒PLRV的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求2-6任一项所述的反转录环介导等温扩增RT-LAMP检测试剂。

8.权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒在如下任一中的应用： （1）检测或辅助检测马铃薯卷叶病毒PLRV；

（2）制备用于检测或辅助检测马铃薯卷叶病毒PLRV的产品；

（3）检测或辅助检测待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒PLRV；

（4）制备用于检测或辅助检测待测植物样品是否为感染马铃薯卷叶病毒PLRV的产品；

（5）检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒PLRV；

（6）制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒PLRV的产品。

9.一种检测或辅助检测待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒PLRV的方法，其特征在于：包括以下步骤： （1）从待测植物样品中提取基因组RNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行反转录环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述反转录环介导等温扩增的反应条件为：60℃反应50 min；

（2）按照下述任一方法确定待测植物样品是否感染马铃薯卷叶病毒PLRV：

A、反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现典型的阶梯状条带即为阳性；

B、加入1µL 1000× SYBR GreenⅠ，振荡混匀，直接目视观察结果，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色；

C、加入1µL50× SYBR GreenⅠ，振荡混匀，紫外线下观察结果，阳性样品发出强荧光，阴性样品不发出强荧光。

10.一种检测或辅助检测待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒PLRV的方法，其特征在于：包括以下步骤： （1）从待测病毒中提取基因组RNA作为模板，采用权利要求2-6任一项所述的检测试剂或权利要求7所述的检测试剂盒进行反转录环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述反转录环介导等温扩增的反应条件为：60℃反应50 min；

（2）按照下述任一方法确定待测病毒是否为马铃薯卷叶病毒PLRV：

A、反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，出现典型的阶梯状条带即为阳性；

B、加入1µL 1000× SYBR GreenⅠ，振荡混匀，直接目视观察结果，阳性产物颜色变为绿色，阴性产物颜色为褐色；

C、加入1µL50× SYBR GreenⅠ，振荡混匀，紫外线下观察结果，阳性样品发出强荧光，阴性样品不发出强荧光。